乙酰化玉竹多糖的合成工藝優化

呂 偉，陳子龍，劉思美，尹秀麗，張麗華，趙 鵬

(1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，陜西 西安 710065；2.渭南市食品藥品檢驗所，陜西 渭南 714000；3.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046)

玉竹為百合科植物玉竹(Polygonatumodoratums(Mill.)Druce)的干燥根莖，也被稱為玉參、鈴鐺菜、甜草根等[1]，廣泛分布于我國西南地區，是一種歷史悠久的藥食兩用藥材[2-4]。多糖是玉竹的主要活性成分之一，具有降血糖、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫、調節糖脂代謝等多種生理活性[5-6]。對多糖進行化學修飾可賦予其一些新的理化性質，提高其生物活性，是目前多糖研究的熱點之一[7]。其中乙酰化是最常見的多糖修飾方法，多糖經乙酰化修飾后，其抗氧化和抗腫瘤活性均得到一定程度的提高[8-9]。

目前，對于玉竹多糖的研究多集中在分離純化、結構分析和活性評價等方面，而通過乙酰化來提高玉竹多糖活性的研究尚未見報道。基于此，作者通過乙酸酐法合成乙酰化玉竹多糖，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化乙酰化玉竹多糖的合成工藝，以期為玉竹多糖的深入開發提供一定的研究基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

玉竹飲片，購于陜西省西安市萬壽路中藥材批發市場，經陜西中醫藥大學趙鵬教授鑒定為百合科植物玉竹(Polygonatumodoratums(Mill.)Druce)的干燥根莖。

β-D-五乙酰葡萄糖標準品、透析袋(MW=3500)，上海源葉生物科技有限公司；乙酸酐、濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉等試劑均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

UV-2550型紫外可見分光光度儀，上海愛朗儀器有限公司；FA2004型電子天平，上海民橋精科天平廠；TDZ5-WS型臺式離心機，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；4.5 L型真空冷凍干燥機，美國Labconco公司；RE-52A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 乙酰化玉竹多糖的合成

1.2.1 玉竹多糖的提取

稱取干燥后的玉竹飲片300 g，粉碎過60目篩，加入12倍質量的水，加熱至微沸并保持1.5 h，過濾，得濾液；藥渣加入10倍質量的水再提取1.5 h，過濾；合并濾液，濃縮至原體積的10%，濃縮液冷卻至室溫，加入4倍體積的無水乙醇醇沉；醇沉結束后靜置24 h，抽濾，將濾餅于80 ℃下烘干，即得玉竹粗多糖。將粗多糖配成飽和溶液，利用Sevage法脫蛋白，再用雙氧水法脫色；脫色后的玉竹多糖裝入透析袋中，流水透析48 h，去離子水再透析24 h，透析液濃縮，凍干，即得玉竹多糖。

1.2.2 玉竹多糖的乙酰化

根據文獻[10-12]的乙酰化方法，略加調整。稱取3.0 g玉竹多糖，用去離子水配成飽和溶液，加入20%氫氧化鈉溶液調節pH值為9.0，升溫至一定溫度，緩慢滴加一定量的乙酸酐；滴加結束后恒溫反應，直至乙酰化反應完全；取出反應液，加入2.0 mol·L-1稀鹽酸調節pH值至7.0，將反應液置于透析袋中，流水透析3 d，取出透析液，真空下濃縮成膏狀物，凍干，即得乙酰化玉竹多糖。

1.3 玉竹多糖乙酰化取代度的測定

根據文獻[9-10]方法繪制β-D-五乙酰葡萄糖標準曲線，擬合得到線性回歸方程：A=16.714c+0.0795，R2=0.9915。β-D-五乙酰葡萄糖濃度在0.01～0.09 mg·mL-1范圍內時，與吸光度線性關系較好。根據標準曲線方程，計算樣品中乙酰基含量。按下式計算玉竹多糖乙酰化取代度：

1.4 乙酰化玉竹多糖的合成工藝優化

1.4.1 單因素實驗

采用單因素實驗分別考察反應時間(2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h)、物料比[m(乙酸酐)∶m(玉竹多糖)，1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1]、反應溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對玉竹多糖乙酰化取代度的影響。

1.4.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，以玉竹多糖乙酰化取代度為響應值，以反應時間、物料比、反應溫度為響應變量，進行響應面實驗。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 反應時間的影響

在反應溫度為50 ℃、物料比為1.5∶1的條件下，考察反應時間對玉竹多糖乙酰化取代度的影響，結果如圖1所示。

圖1 反應時間對玉竹多糖乙酰化取代度的影響

從圖1可知，隨著反應時間的延長，玉竹多糖乙酰化取代度逐漸增大，當反應時間為3.5 h時，取代度達到最大；繼續延長反應時間，取代度呈略微下降趨勢，可能是由于，反應時間過長使部分乙酰化玉竹多糖發生了分解，從而降低了取代度。因此，以3.5 h為響應面實驗反應時間的中心點。

2.1.2 物料比的影響

在反應溫度為50 ℃、反應時間為3.5 h的條件下，考察物料比對玉竹多糖乙酰化取代度的影響，結果如圖2所示。

圖2 物料比對玉竹多糖乙酰化取代度的影響

從圖2可知，隨著物料比的增大，玉竹多糖乙酰化取代度逐漸增大，這是由于，隨著乙酸酐用量的增加，玉竹多糖與乙酰化試劑碰撞的幾率增大，促進了反應的進行；當物料比為2.5∶1時，取代度達到最大；繼續增大物料比，此時乙酸酐的水解速度超過了乙酰化反應速度，反應液的pH值下降，導致取代度下降。因此，確定2.5∶1為響應面實驗物料比的中心點。

2.1.3 反應溫度的影響

在物料比為2.5∶1、反應時間為3.5 h的條件下，考察反應溫度對玉竹多糖乙酰化取代度的影響，結果如圖3所示。

從圖3可知，隨著反應溫度的升高，玉竹多糖乙酰化取代度呈迅速增大的趨勢，當反應溫度為60 ℃時，取代度達到最大；繼續升高反應溫度，取代度逐漸下降。這可能是由于，反應溫度的升高，有助于增強底物的反應活性，使得取代度增大；當反應溫度超過60 ℃后，過高的反應溫度可能使乙酸酐的水解速度超過了乙酰化反應速度，反應液的pH值下降，并造成部分乙酰化玉竹多糖發生了分解，導致取代度下降。因此，確定60 ℃為響應面實驗反應溫度的中心點。

圖3 反應溫度對玉竹多糖乙酰化取代度的影響

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果

響應面實驗的因素與水平見表1，結果見表2。

表1 響應面實驗的因素與水平

表2 響應面實驗設計及結果

回歸模型的方差分析見表3。

表3 方差分析

2.2.2 響應面分析

各因素交互作用對玉竹多糖乙酰化取代度影響的響應面圖如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對玉竹多糖乙酰化取代度影響的響應面圖

響應面及所對應的等高線可反映單因素交互作用影響的顯著性，響應面趨于圓形，說明兩因素的交互作用影響不顯著；反之，響應面趨于橢圓形，說明兩因素的交互作用影響顯著[15-17]。由圖4可知，3個因素之間的交互作用影響均較大。其中，反應溫度的曲線最為密集陡峭，其對玉竹多糖乙酰化取代度的影響最大。

對回歸方程求一階偏導并使之等于0[18]，X1=-0.12，X2=0.431，X3=-0.258，由此可得預測的乙酰化玉竹多糖的最佳合成工藝如下：反應時間為3.44 h、物料比2.7155∶1、反應溫度為57.42 ℃，取代度預測值為0.358。綜合考慮預測的實驗結果及實際操作可行性，將乙酰化玉竹多糖的最佳合成工藝調整為：反應時間3.44 h、物料比為2.7155∶1、反應溫度60 ℃，在此條件下進行3次驗證實驗，取代度平均值為0.351。表明通過響應面法預測的玉竹多糖乙酰化取代度與實際值基本吻合。

3 結論

通過乙酸酐法合成乙酰化玉竹多糖，確定最佳合成工藝如下：反應時間為3.44 h、物料比m(乙酸酐)∶m(玉竹多糖)為2.7155∶1、反應溫度為60 ℃，在此條件下，玉竹多糖乙酰化取代度為0.351。該工藝路線可行，具有反應條件溫和、試劑廉價易得、多糖乙酰化取代度較高、易于放大生產等優點，是一種較理想的多糖乙酰化修飾方法。