響應面法優化婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取工藝

張思懿，許寧俠*，方曉艾，崔 寧，王 培，陳 伶，高 健，李晨茜

(1.西安外事學院醫學院，陜西 西安710077；2.精準抗衰健康產品研發與轉化陜西省高校工程研究中心，陜西 西安710077)

婺源皇菊(WuyuanChrysanthemummorifolium)是菊科菊屬多年生植物，其性味甘、苦、微寒，歸肺、肝經，在我國有著悠久的種植及食用歷史[1]?，F代研究表明，皇菊的主要化學成分為黃酮類[2]、多糖類[3]、水溶性色素類[4]、揮發油類[5]等，具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓、抑制血小板聚集、增加冠狀動脈血流量、抗氧化、抗癌等藥理作用[6]。從皇菊中獲取黃酮類化合物，具有來源豐富、簡單易得等優點。

黃酮類化合物的提取通常采用溶劑萃取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等。其中，溶劑萃取法因成本低、簡單易行，應用較為廣泛。楊琳琳[7]采用乙醇回流法提取黑心菊花瓣中黃酮類化合物，黃酮提取率為4.719%。饒桂維等[8]采用超聲輔助水提法提取婺源皇菊總黃酮，發現存在耗時較長、提取率較低、提取物較難分離等缺點。超聲輔助溶劑提取法具有一定的優勢，如鄭曉文[9]發現，采用超聲輔助乙醇法提取皇菊總黃酮，其總黃酮提取率高于單純的乙醇提取法。目前，關于皇菊總黃酮的提取研究多數基于金絲皇菊，而對婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取研究鮮有報道。鑒于此，作者在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取工藝，在常規考察3因素的基礎上，同時考察離心速率對總黃酮提取率的影響[10]，并對婺源皇菊總黃酮的體外抗氧化活性進行評價，以期為婺源皇菊的進一步開發與利用提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

婺源皇菊，江西歙縣峰日茶菊有限公司。經西安外事學院王漢屏教授鑒定為菊科菊屬皇菊。

無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫，福晨天津化學試劑有限公司；L-抗壞血酸，美國Sigma-Aldrich 公司；蘆丁標準品(純度>98%)，上海如吉生物科技發展有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

UV-mini1258型紫外可見分光光度計，日本株式會社島津；SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝；高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品200.0 mg，用50%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，得濃度為2.0 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。精密吸取蘆丁標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，采用 NaNO2-Al(NO3)3法[11]測定510 nm 處吸光度，以50%乙醇為空白對照，測定3次，結果取平均值。以蘆丁濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程為：A=1.555c+0.0151，R2=0.9994。表明蘆丁濃度在0.2～1.2 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

1.3 婺源皇菊總黃酮的提取

將婺源皇菊花萼在60 ℃下干燥至恒重，粉碎后，過 80目篩，備用。準確稱取婺源皇菊粉末1.0 g，加入一定體積分數的乙醇，充分搖勻后，進行超聲提取，共提取3次，合并提取液；將提取液在一定轉速下離心10 min，取上清液，得到婺源皇菊總黃酮提取液。

精密量取 1 mL婺源皇菊總黃酮提取液置于50 mL 容量瓶中，采用 NaNO2-Al(NO3)3法[11]測定510 nm 處吸光度，根據標準曲線方程計算總黃酮濃度，按式(1)計算婺源皇菊總黃酮提取率。

(1)

式中：c為提取液中總黃酮濃度，mg·mL-1；n為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；m為婺源皇菊粉末質量，g。

1.4 婺源皇菊總黃酮提取工藝優化

1.4.1 單因素實驗

分別考察乙醇體積分數(50%、60%、70%、75%、95%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、超聲時間(20 min、30 min、50 min、60 min、90 min)、離心速率(1 500 r·min-1、2 500 r·min-1、3 500 r·min-1、5 500 r·min-1、6 000 r·min-1)對婺源皇菊總黃酮提取率的影響。

1.4.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，以乙醇體積分數、料液比、超聲時間和離心速率為變量，以總黃酮提取率為響應值，采用Box-Behnken中心組合設計4因素3水平實驗，進行響應面分析。使用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據處理和分析，通過ANOVA分析實驗結果[12]。

1.5 體外抗氧化活性評價

將婺源皇菊總黃酮提取液分別配成濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、8.0 mg·mL-1的樣品溶液。精密吸取1 mL樣品溶液置于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、1 mL 9 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2溶液，加水至刻度，搖勻，37 ℃水浴30 min后，冷卻，測定510 nm處吸光度(A1)；以無水乙醇為對照組(A0)，以水為空白組(A2)；以同濃度的VC作為陽性對照。按式(2)計算羥基自由基清除率。

(2)

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖1)

注：超聲時間60 min、料液比1∶30、離心速率3 500 r·min-1

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的增大，婺源皇菊總黃酮提取率先升高后降低，當乙醇體積分數為70%時，總黃酮提取率達到最高，為22.95 mg·g-1?？赡苁且驗?，乙醇與總黃酮的極性相似，根據相似相溶原理，當乙醇體積分數增大時，總黃酮提取率隨之上升；但當乙醇體積分數過大時，醇溶性物質如蛋白質等溶出增多，從而導致總黃酮提取率降低。因此，選擇乙醇體積分數為70%。

2.1.2 料液比對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖2)

注：超聲時間60 min、乙醇體積分數70%、離心速率3 500 r·min-1

由圖2可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，婺源皇菊總黃酮提取率逐漸降低，當料液比為1∶10時，總黃酮提取率最高，為37.51 mg·g-1?？赡苁且驗?，在適當的料液比范圍內溶質分散良好，加熱效率高，有利于總黃酮分子的釋放，總黃酮提取率較高；但提取溶劑用量過多時，其它成分溶出，導致單位體積內總黃酮的分子數減少。因此，選擇料液比為1∶10。

2.1.3 超聲時間對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖3)

注：乙醇體積分數70%、離心速率3 500 r·min-1、料液比1∶30

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，婺源皇菊總黃酮提取率先升高后降低，當超聲時間為50 min時，總黃酮提取率達到最高，為23.46 mg·g-1?？赡苁且驗?，在50 min內，婺源皇菊細胞內黃酮類化合物溶出速率較快，總黃酮提取率顯著提高；超過50 min后，由于超聲波的機械效應和熱能加快了分子運動，進而破壞了黃酮類化合物的結構，另外超聲時間過長，促使其它成分溶出，導致總黃酮提取率降低。因此，選擇超聲時間為50 min。

2.1.4 離心速率對婺源皇菊總黃酮提取率的影響(圖4)

注：超聲時間50 min、乙醇體積分數70%、料液比1∶30

由圖4可知，隨著離心速率的加快，婺源皇菊總黃酮提取率先升高后降低，當離心速率為3 500 r·min-1時，總黃酮提取率達到最高，為22.85 mg·g-1。通過離心分離，高速旋轉產生的離心力遠遠大于重力，可大大提高較細物質的沉降速率，只需較短的時間即可達到較好的分離效果。因此，選擇離心速率為3 500 r·min-1。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果(表1)

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表1數據進行處理，得到二次多元回歸模型方程:Y=39.74+3.68A+7.2B+0.87C+0.6D-1.4AB+8.93×10-3AC+3.76AD+0.66BC-0.45BD-0.29CD-170A2-794B2-62C2+40D2。

回歸模型的方差分析見表2。

表2 回歸模型的方差分析

2.2.2 響應面分析

各因素交互作用對婺源皇菊總黃酮提取率影響的響應面圖及等高線圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對婺源皇菊總黃酮提取率影響的響應面圖及等高線圖

由圖5可知，婺源皇菊總黃酮提取率隨乙醇體積分數、料液比、超聲時間和離心速率的上升而升高，到達中心點后呈下降趨勢。料液比對總黃酮提取率的影響大于乙醇體積分數[13-15](圖5a)。通過分析響應面圖發現，乙醇體積分數與料液比、料液比與離心速率的交互作用明顯，表現為曲線較陡，響應值變化較大；乙醇體積分數與超聲時間、超聲時間與離心速率的交互曲線較為平滑，響應值變化較小。通過分析等高線圖發現，乙醇體積分數與料液比的交互作用對總黃酮提取率的影響最顯著，表現為等高線最密集；料液比與超聲時間的交互作用對總黃酮提取率的影響次之，超聲時間與離心速率的交互作用對總黃酮提取率的影響最不明顯。

2.3 最佳工藝的確定

通過響應面分析，預測婺源皇菊總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數72%、料液比1∶10(g∶mL)、超聲時間44.48 min、離心速率2 700 r·min-1?？紤]實際操作的可行性，將最佳提取工藝條件修正為：乙醇體積分數70%、料液比1∶10、超聲時間45 min、離心速率2 700 r·min-1，在此條件下，總黃酮提取率為39.943 mg·g-1，與模型預測值(40.950 mg·g-1)相差不大，說明響應面優化回歸模型對實際工藝操作具有一定的指導意義。

2.4 體外抗氧化活性

婺源皇菊總黃酮對羥基自由基的清除率如圖6所示。

圖6 婺源皇菊總黃酮對羥基自由基的清除率

從圖6可知，婺源皇菊總黃酮和VC對羥基自由基的清除率均隨濃度的增加而升高，當婺源皇菊總黃酮濃度由0.1 mg·mL-1增至0.8 mg·mL-1時，羥基自由基清除率從72.28%升至79.60%。由此可見，婺源皇菊總黃酮具有明顯的抗氧化能力。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化婺源皇菊總黃酮的超聲輔助溶劑提取工藝，確定最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數70%、料液比1∶10(g∶mL)、超聲時間45 min、離心速率 2 700 r·min-1，在此條件下，婺源皇菊總黃酮提取率為 39.943 mg·g-1，與模型預測值(40.950 mg·g-1)相差不大，表明該模型擬合度較好。此外，通過單因素實驗發現，離心速率在3 500 r·min-1時，婺源皇菊總黃酮提取率達到最高(22.85 mg·g-1)，可知離心速率對總黃酮提取率有一定的影響，該機制有待后期進一步深入研究。體外抗氧化實驗結果表明，婺源皇菊總黃酮對羥基自由基具有明顯的清除活性，具有一定的潛在開發價值，可作為一種新型的抗氧化劑應用于藥品、食品及化妝品等領域。后期可對婺源皇菊總黃酮體內抗氧化活性及抗氧化機理進行更深入的研究。