滇西北地區魚腥草抗氧化活性研究

倪 俊，靖恒燁，高玉婷，佘 容，楊曉燕,3,4*

(1.大理大學 天然抗氧化劑和抗氧化炎癥研究院，云南 大理 671003；2.大理大學 東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；3.中國三江并流區域生物多樣性協同創新中心，云南 大理 671003；4.大理大學 三江并流區域生物多樣性保護與利用云南省創新團隊，云南 大理 671003)

隨著人們生活水平的提高，抗氧化研究成為當今的研究熱點。目前，已發現了大量抗氧化物質，其中不乏一些效果優良的抗氧化物質，如水溶性的VC和脂溶性的VE，但隨著研究的不斷深入，發現長期服用VC或VE會對人體產生副作用[1]。因此，在大健康時代，開發無毒、無害、易降解、對人體副作用更小、功效更持久的抗氧化物質成為抗氧化研究領域的主流趨勢[2]。

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)，又名折耳根，屬三百草科(Saururaceae)蕺菜屬(Houttuynia)，廣泛分布于云南、四川和貴州等地[3]，是衛生部確定的藥食同源植物之一[4]。現代研究表明，魚腥草中的揮發油、多糖、多酚和黃酮等物質均具有較強的抗氧化活性[5]。但是由于各地區生境不同，各地區的魚腥草在外觀、營養成分和含量上都會存在差異[6]。滇西北位于云南省西北部橫斷山區核心區域，是青藏高原至云貴高原的過渡地帶，擁有獨特的地形地貌和復雜的氣候條件[7]。為此，作者分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和水等溶劑對滇西北地區魚腥草的活性成分進行提取，通過DPPH法、ABTS法、FRAP法對其抗氧化活性進行綜合評價，并與其它地區魚腥草的抗氧化活性進行比較，探究滇西北地區魚腥草作為天然抗氧化物質的可能性和優勢，也為抗氧化物質產地的篩選提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮滇西北地區魚腥草，購于大理古城菜市場。

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、DPPH、VC、ABTS、過二硫酸鉀、無水醋酸鈉、冰乙酸、HCl、FeSO4、TPTZ(三吡啶三嗪)等均為分析純。

722N型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機、SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；PX224ZH型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；DZG-303A型超純水機，成都艾柯水處理設備有限公司；GZX-9070 MBE型數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司。

1.2 魚腥草提取物的制備

將滇西北地區魚腥草洗凈，置于40 ℃鼓風干燥箱中干燥至恒重，粉碎，過60目篩，-20 ℃保存備用。準確稱取 5份魚腥草粉末各50 g，置于500 mL錐形瓶中，按料液比1∶10(g∶mL)分別加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、蒸餾水，30 ℃、60 Hz超聲提取1 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，用無水乙醇或反滲透純水溶解，再冷凍干燥至恒重。

1.3 魚腥草提取物的抗氧化活性評價

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基工作液的配制：精確稱取DPPH粉末1 g，用無水乙醇溶解后定容至1 L，得濃度為1 g·L-1的DPPH自由基儲備液，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。吸取DPPH自由基儲備液2 mL，加入無水乙醇18 mL，配制100 mg·L-1的DPPH自由基工作液。

DPPH自由基標準曲線的繪制：用無水乙醇將DPPH自由基工作液稀釋成梯度濃度100 mg·L-1、80 mg·L-1、60 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1、10 mg·L-1、5 mg·L-1，測定517 nm處吸光度，每個濃度設置6個重復；以DPPH自由基濃度為橫坐標、517 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

DPPH自由基清除率的測定[8]：取適量魚腥草提取物，用無水乙醇依次稀釋成濃度(g·L-1)分別為2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5的樣品溶液；分別將不同濃度的樣品溶液與100 mg·L-1DPPH自由基工作液按體積比1∶1混勻，37 ℃水浴0.5 h后，測定517 nm處吸光度，每個濃度設置6個重復；以等濃度VC為陽性對照，同時設置樣品對照和空白對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：A1為樣品溶液+DPPH自由基工作液的吸光度；A2為樣品溶液+無水乙醇的吸光度；A0為無水乙醇+DPPH自由基工作液的吸光度。

1.3.2 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基工作液的配制：將7 mmol·L-1ABTS自由基溶液和4.9 mmol·L-1K2S2O8溶液按體積比1∶1混勻，避光反應16 h，即為ABTS自由基母液，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。取適量ABTS自由基母液，用無水乙醇稀釋至其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02，即為ABTS自由基工作液。

ABTS自由基清除率的測定[9]：取適量魚腥草提取物，用無水乙醇依次稀釋成濃度(g·L-1)分別為1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625的樣品溶液；分別將不同濃度的樣品溶液與ABTS自由基工作液按體積比1∶1混勻，室溫下反應6 min后，測定734 nm處吸光度，每個濃度設置6個重復；以等濃度VC為陽性對照，同時設置樣品對照和空白對照。按式(2)計算ABTS自由基清除率：

(2)

式中：A1為樣品溶液+ABTS自由基工作液的吸光度；A2為樣品溶液+無水乙醇的吸光度；A0為無水乙醇+ABTS自由基工作液的吸光度。

1.3.3 總抗氧化能力的測定

FRAP工作液的配制：將0.3 mol·L-1醋酸緩沖液(pH值3.6)、10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混勻，即為FRAP工作液。

FeSO4標準曲線的繪制：取0.1 mL 0.1～1.6 mmol·L-1的FeSO4標準溶液與2.4 mL FRAP工作液混勻，37 ℃水浴10 min后，測定593 nm處吸光度；以FeSO4濃度為橫坐標、593 nm處吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

總抗氧化能力的測定[10]：取適量魚腥草提取物，用無水乙醇依次稀釋成濃度(g·L-1)分別為20、15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5的樣品溶液。取0.1 mL不同濃度的的樣品溶液與2.4 mL FRAP工作液混勻，37 ℃水浴10 min后，測定593 nm處吸光度，每個濃度設置6個重復；同時設置空白對照。以FRAP值表征總抗氧化活性，以1 mmol·L-1FeSO4溶液為標準，當樣品的總抗氧化活性達到同樣吸光度時為一個FRAP值。按式(3)計算FRAP值：

(3)

式中：A1為樣品管的吸光度；A2為空白對照管的吸光度；A0為1 mmol·L-1FeSO4溶液的吸光度。

1.4 數據分析

采用GraphPad Prism 7.00軟件和Excel軟件繪制魚腥草提取物濃度與抗氧化活性的關系曲線，并采用SPSS 20.0軟件計算各提取物和VC對DPPH和ABTS自由基的清除能力(IC50)，最后通過計算提取物與VC 的IC50比值得到提取物的比活性。

2 結果與討論

2.1 DPPH自由基清除能力

2.1.1 DPPH自由基標準曲線(圖1)

由圖1可知，DPPH自由基濃度在5～100 mg·L-1范圍內時，與吸光度線性關系較好，線性回歸方程為：y=0.0198x-0.0433，R2=0.998。

圖1 DPPH自由基標準曲線

2.1.2 魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力(圖2)

由圖2可知，魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率均隨提取物濃度的增加逐漸升高，但對DPPH自由基的清除能力各異。相比較而言，95%乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力最強(IC50值為0.45 g·L-1，相對于VC的比活性為1.4%)。在相同條件下，各提取物對DPPH自由基清除能力的強弱順序為：95%乙醇提取物>水提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物>乙酸乙酯提取物。

圖2 魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力

通過對魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率進行差異性分析(圖3)發現，95%乙醇提取物、石油醚提取物和乙酸乙酯提取物分別與其它4種提取物的IC50值均存在顯著性差異，水提取物與正丁醇提取物的IC50值差異不顯著，但與其它3種提取物的IC50值均存在顯著性差異。

圖3 魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基清除率的差異性分析

2.2 ABTS自由基清除能力(圖4)

由圖4可知，魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率均隨提取物濃度的增加逐漸升高，呈劑量效應關系，但對ABTS自由基的清除能力各異。95%乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力最強(IC50值為0.025 6 g·L-1，相對于VC的比活性為28.6%)。在相同條件下，各提取物對ABTS自由基清除能力的強弱順序為：95%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物>水提取物。

圖4 魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除能力

通過對魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率進行差異性分析(圖5)發現，石油醚提取物和水提取物分別與其它4種提取物的IC50值均存在顯著性差異，乙酸乙酯提取物與正丁醇提取物、95%乙醇提取物的IC50值差異不顯著，但乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、95%乙醇提取物與其它2種提取物的IC50值均存在顯著性差異。

圖5 魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基清除率的差異性分析

2.3 總抗氧化能力

2.3.1 FeSO4標準曲線(圖6)

圖6 FeSO4標準曲線

由圖6可知，FeSO4溶液濃度在0.1～1.6 mmol·L-1范圍內時，與吸光度線性關系較好，線性回歸方程為：y=0.6012x+0.0429，R2=0.9937。

2.3.2 魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力(圖7)

圖7 魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力

由圖7可知，魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力存在差異，整體均隨提取物濃度的增加逐漸升高。當濃度為20 g·L-1時，95%乙醇提取物的總抗氧化能力最強，FRAP值達到了3.59。在濃度為20 g·L-1下，各提取物的總抗氧化能力強弱順序為：95%乙醇提取物>正丁醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。

通過對魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力進行差異性分析(圖8)發現，乙酸乙酯提取物、石油醚提取物和水提取物分別與其它4種提取物的FRAP值均存在顯著性差異，95%乙醇提取物與正丁醇提取物的FRAP值差異不顯著，但與其它3種提取物的FRAP值均存在顯著性差異。

圖8 魚腥草不同溶劑提取物總抗氧化能力的差異性分析

2.4 討論

2.4.1 滇西北地區魚腥草與其它地區魚腥草的抗氧化活性比較

在中藥材活性成分的研究中，產地是其活性的關鍵影響因素之一。對相關研究報道進行比較分析發現，滇西北地區魚腥草95%乙醇提取物的抗氧化能力略低于鄂西北地區魚腥草的[11]，略強于湖南魚腥草的[12]；其水提取物的抗氧化能力低于廣西魚腥草的[13]，強于四川魚腥草的[14]；其石油醚提取物的抗氧化能力強于江西魚腥草的[15]。由此可見，地區差異會影響魚腥草的抗氧化活性成分，整體來說滇西北地區魚腥草的抗氧化活性較高，這可能是由于，滇西北地區的高海拔、強光照、低氧含量和晝夜溫差大等條件提高了該地區魚腥草的抗氧化活性。因此，云貴高原地區和青藏高原地區可能是天然抗氧化物質篩選的理想產地。當然，本研究結果僅是粗提物的評估結果，粗提物成分復雜，無法確定活性物質，同時粗提物中可能存在影響實驗結果的物質。如需進一步闡明不同地區魚腥草的抗氧化活性差異，還需對粗提物進行分離純化，確定其發揮抗氧化效果的有效成分及其含量差異等。

2.4.2 提取溶劑對魚腥草抗氧化活性評價的影響

現階段對魚腥草抗氧化活性的研究多集中在魚腥草的石油醚提取物的揮發油成分[15]、乙醇提取物多酚成分[16]和水提取物多糖成分[17]。從本研究結果來看，魚腥草5種提取物均具有較強的抗氧化活性且存在差異，其中95%乙醇提取物的抗氧化活性最強。一方面可能是由于，魚腥草多酚含量高，而多酚易溶于乙醇[18]，導致其粗提物中多酚含量高；另一方面，也可能是由于多酚的抗氧化活性高于其它提取溶劑所得活性成分，如茶多酚的抗氧化能力是VE的10～20倍，是VC的100倍[19]。本研究中，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物也表現出了較強的抗氧化活性，而這2種提取物主要含黃酮和苷類化合物[20]，而糖苷類化合物和花青苷類化合物均具有抗癌、抗炎和抗氧化等功效[21]。

2.4.3 抗氧化活性評價指標的選擇探究

從本研究結果來看，魚腥草同種提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力存在差異，如95%乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50值分別為0.45 g·L-1和0.025 6 g·L-1。主要是因為，DPPH自由基的反應機制是基于氫原子轉移機制，而ABTS自由基的反應機制同時包括了氫原子轉移機制和單電子轉移機制[22]，因此，在相同濃度下，ABTS自由基活性高于DPPH自由基的[23]。另外，乙酸乙酯提取物對ABTS自由基的清除能力高于水提取物的，但乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除能力卻低于水提取物的。這說明對于成分復雜樣品的抗氧化活性評價不應基于單一的抗氧化模型，應進行幾種體外抗氧化實驗來綜合評價樣品的抗氧化活性[24]。同時，DPPH、ABTS自由基都屬于氮自由基[25-26]且是非人體自由基[27]，若要對樣品進行綜合、有效的評價，則需增加如羥基自由基、超氧陰離子自由基等人體自由基指標。故建議對于樣品抗氧化能力的測定應采用多種指標綜合評價。

3 結論

采用DPPH法、ABTS法、FRAP法對滇西北地區魚腥草石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、95%乙醇提取物和水提取物的抗氧化活性進行評價。結果表明，魚腥草5種提取物均具有一定的抗氧化活性，其中95%乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力最強，IC50值分別為0.45 g·L-1、0.025 6 g·L-1，與VC的比活性分別為1.4%、28.6%；95%乙醇提取物的總抗氧化能力也最強，FRAP值為3.59。3種評價結果顯示滇西北地區魚腥草具有較強的體外抗氧化活性，可作為天然抗氧化物質開發的優選對象。