三種食用菌多糖的基本結構與抗氧化活性研究

向瑞琪，謝 鋒,,*，譚 紅，李占彬，孫曉紅

（1.貴州醫科大學公共衛生學院與健康學院，環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省分析測試研究院，貴州貴陽 550000；3.貴州科學院，貴州貴陽 550000）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata）被稱為“山珍之王”和“菌中王后”，是貴州省的特色食用菌產業之一，在貴州的栽培技術水平、產量和產值均為全國第一[1]。紅托竹蓀子實體分為菌蓋、菌柄和菌托3 個部分。其中不可食用的菌托約占整個竹蓀鮮重的50%，采摘后被去掉，造成了資源浪費和環境污染[2-3]。食用菌中主要活性成分是多糖[4]，具有降血脂、降血糖[5]、抗氧化、延緩衰老[6]、抗凝血、免疫調節[7]、抗腫瘤和抗病毒等[8-10]功效。研究發現紅托竹蓀菌托中的多糖是三個部分中含量最高、體外抗氧化活性最強的[11]。近年來關于紅托竹蓀多糖的研究主要集中在子實體可食部分的提取及其抗氧化，而關于紅托竹蓀菌托多糖的研究較少。滕春麗等[12]研究超聲提取紅托竹蓀多糖的工藝及其膜分離方法；王新等[13]研究了紅托竹蓀子實體多糖對耐缺氧及抗運動疲勞效果的影響；葉敏等[14]比較了不同去蛋白方法對紅托竹蓀子實體多糖損失率和脫蛋白效果。

以上研究中均未有對紅托竹蓀的邊角廢料菌托的結構與生物活性的相關探究，因此為探索其構效關系，并與同為貴州省食用菌重點產業的香菇和黑木耳對比，提取三種食用菌多糖后去蛋白透析。采用紫外分光光度計、高效凝膠色譜（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）、紅外光譜（Infrared spectrum，IR）、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）和剛果紅實驗對比分析紅托竹蓀菌托中多糖與其他食用菌多糖的基本結構。通過清除DPPH 和OH 自由基的能力及Fe3+總還原力來比較三種食用菌多糖抗氧化能力，為利用紅托竹蓀邊角廢料于工業化生產多糖制品，代替昂貴的食用菌多糖食品，開發紅托竹蓀邊角廢料的利用價值和食用菌深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香菇、黑木耳、紅托竹蓀菌托 貴州省梵天菌業有限公司提供；標準品葡聚糖Dextran 系列（T-2000、T-150、T-40、T10、T-5） 美國Sigma 公司；溴化鉀光譜純，上海阿拉丁試劑有限公司；透析袋3500 Da 北京索萊寶科技有限公司；鐵氰化鉀 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 純度98%，上海源葉生物科技有限公司；其他化學試劑 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

BSM220.4 電子天平 上海卓精電子科技有限公司；Milli-Q 實驗室超純水系統 昆明倍捷科技有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋 金壇區西城新瑞儀器廠；1901PC 紫外可見光分光光度計、723S可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；1525 型高效液相色譜儀 美國Waters 公司；iCAN 9 傅里葉變換紅外光譜儀 天津市能譜科技有限公司；Bruker Avance III-600 MHz 超導核磁共振儀瑞士Bruker 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 食用菌多糖的制備 分別稱取粉碎后的食用菌10 g，按照料液比1:25（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃提取2 h。抽濾后收集濾液，濾渣在相同條件下重復提取后合并兩次濾液濃縮。加入適量的無水乙醇，配制成95%的乙醇濃度，室溫下放置過夜。4000 r/min下離心，棄去上層乙醇溶液，底部沉淀加水溶解。采用Sevag 法去除蛋白[15]，加入4 倍體積的Sevag 試劑，勻漿機攪拌20 min 后離心，去除中間層的變性蛋白，重復以上步驟至無蛋白。濃縮后裝入透析袋中流水透析2 d，冷凍干燥后得到三種食用菌多糖。采用苯酚-硫酸法分別測定三種食用菌多糖純度[16]。

1.2.2 紫外光譜分析 稱取樣品用水配制成1 mg/mL的溶液，在190～400 nm 處的紫外分光光度計進行全掃描。

1.2.3 相對分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法（ High-Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）測定三種食用菌的相對分子量[17]。測試條件：Waters 1525 型色譜儀，示差折光檢測器；色譜柱：Ultrahydrogel? Linear（300 mm×7.8 mm id×2）；流動相：0.1 mol/L 硝酸鈉溶液；流速：0.9 mL/min；柱溫：45 ℃。

葡萄標準曲線：稱取Dextran T-2000（MW2×107）、T-150（MW133850）、T-40（MW36800）、T10（MW9750）、T-5（MW2700）、MW180）標準品用流動相溶解配制成5 mg/mL 的標準分子量溶液。以洗脫峰的保留時間T（min）為橫坐標，葡聚糖標準品分子量的對數值lgMW 為縱坐標，其回歸方程為y=13.8534x-0.4627，R2=0.9991。Breeze GPC 軟件對曲線進行回歸擬合繪制分子量校正曲線。

1.2.4 紅外光譜測定 取2 mg 的三種多糖樣品，與100 mg KBr 混勻研磨，壓片后在4000～400 cm-1進行傅里葉紅外光譜測試[18]。

1.2.5 核磁共振分析 取三種食用菌30 mg，溶解于D2O 重水中，移入核磁管中，在25 ℃條件下，用Bruker Avance III-600 MHz 核磁共振波譜儀記錄，1H NMR 在600 MHz 測定，13C NMR 在150 MHz 測定[19]。

1.2.6 剛果紅實驗 參考文獻[20]，分別吸取1 mL配制好的1 mg/mL 不同食用菌多糖溶液與同體積80 μmol/L 剛果紅溶液混合，再加入4 mL 用5 mol/L氫氧化鈉原液配制成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，蒸餾水為空白對照，在25 ℃下反應10 min，400～700 nm 處測量最大吸收波長。

1.2.7 抗氧化性分析

1.2.7.1 DPPH 自由基清除率的測定 根據王瑩等[21]的檢測方法并加以改進。用無水乙醇配制0.08 mol/L的DPPH 溶液。吸取2.0 mL 不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的三種食用菌多糖樣品溶液加入3.0 mL 的DPPH 溶液，混勻后避光反應30 min。蒸餾水為空白對照，于517 nm 波長處測定吸光度值。

式中：A0為蒸餾水+DPPH 溶液的吸光度值；Ac 為樣品溶液+蒸餾水的吸光度值；As 為樣品溶液+DPPH 溶液的吸光度值。

1.2.7.2 Fe3+總還原力測定 參考羅麗平等[22]的測定方法。吸取2.0 mL 不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）的食用菌多糖樣品溶液，依次加入2.5 mL的0.2 mol/L，pH6.6 的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀后在50 ℃水浴鍋中反應20 min。加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，300 r/min 離心10 min。吸取2.5 mL 上清液加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵。蒸餾水為空白對照，700 nm 處測定吸光度值。

式中：Ah為樣品溶液的吸光度值；A0為空白對照的吸光度值。

1.2.7.3 羥基自由基清除率的測定 按照林陳強等[23]的檢測方法并改進。吸取1.0 mL 不同濃度的食用菌多糖樣品溶液（0.5 、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL），依次加入用無水乙醇配制10.0 mmol/L 的水楊酸溶液和9.0 mmol/L 的FeSO4各1.0 mL 混合均勻。再加入2.0 mL 蒸餾水和1.0 mL 6.0 mmol/L 的H2O2，37 ℃水浴反應10 min。蒸餾水為空白對照，在510 nm 處測定吸光度值。

式中：A0為空白對照的吸光度值；As 為樣品+FeSO4+水楊酸+H2O2的吸光度值；Ac 為樣品+FeSO4+水楊酸的吸光度值。

1.3 數據處理

結果表示為平均值±標準差，采用SPSS13.0 軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進行數據統計分析，P＜0.05 被認為是具有顯著性差異。通過Origin 2019軟件對數據進行作圖，每組實驗設置3次重復。

2 結果與分析

2.1 三種食用菌多糖純度測定

以葡萄糖標準品含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得標準線性方程為：y=8.0823x-0.0043，R2=0.9997。以香菇、黑木耳和紅托竹蓀菌托為原料分別制得的多糖含量為78%±0.23%、81%±0.15%和76%±0.36%。三種食用菌提取的多糖含量與研究[24-26]中的多糖含量相比較低，可能是產地和品種的不同所致。

2.2 三種食用菌多糖紫外光譜分析

三種食用菌紫外全掃描如圖1所示，由于三種食用菌多糖的溶液顏色、組成物質及其穩定性的不同導致最大吸光度不同。在260 和280 nm 處紅托竹蓀菌托無特征吸收峰，在260 nm 處香菇和黑木耳有特征吸收峰，說明通過Sevag 脫蛋白和透析后紅托竹蓀菌托多糖樣品不含核酸和蛋白質，而香菇和黑木耳含有少量核酸，不含蛋白質。

圖1 三種食用菌多糖紫外掃描圖譜Fig.1 UV scanning spectra of polysaccharides from three edible fungi

2.3 三種食用菌多糖的相對分子量差異

通過高效凝膠滲透色譜法測定三種不同食用菌多糖的相對分子量，三種樣品中多糖的相對分子質量分布和其分布范圍根據葡聚糖的標準曲線得到，其回歸方程為y=13.3579x-0.5349，R2=0.9991。如表1所示，三種食用菌多糖的分子量分布均出現兩個洗脫峰。其中香菇多糖的重均分子量（Mw）主要分布在1.18×104Da，黑木耳多糖的重均分子量主要分布在1.29×104Da，紅托竹蓀菌托多糖的重均分子量主要分布在3.89×104Da。多分散系數（Mw/Mn）分別為0.61、0.39、1.20，多分散系數接近于1，分子量分布越均一。三種食用菌多糖均分布在萬級和百萬級，并且在分子量分布均一性上紅托竹蓀菌托多糖最好，香菇多糖其次，黑木耳多糖最差。

表1 不同食用菌多糖的相對分子量Table 1 Relative molecular weights of polysaccharides from different edible fungi

2.4 三種食用菌紅外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜法對三種食用菌多糖進行官能團分析。如圖2所示，三種食用菌多糖的特征峰相似。在3400～3200 cm-1處的吸收峰是由O-H 引起的伸縮振動，在2900 cm-1附近的吸收峰是由C-H 伸縮振動引起的。三種食用菌多糖分別在3364、3363 和3335 cm-1附近出現特征峰，證明三種多糖都存在羥基-OH。2925、2933 和2931.72 cm-1是亞甲基-CH2的特征峰，羥基和亞甲基是多糖的特征基團[27]。1600 cm-1附近是酰胺基C=O 的特征吸收峰，而在1417 cm-1附近出現的吸收峰是C=O 對稱伸縮振動引起的，證明三種食用菌多糖含有羧基-COOH。在1100 cm-1附近為C-O-C 伸縮振動吸收峰，是吡喃糖環的特征峰[28]。在860.10、892.88、898.87 cm-1附近是β糖苷鍵的特征吸收峰，674.68、609.40、649.89 cm-1附近是α糖苷鍵特征吸收峰，由圖可知，三種食用菌多糖是既具有α構型又具有β構型的酸性多糖。

2.5 三種食用菌多糖核磁共振分析

在圖3 中，三種食用菌多糖化學位移δ在4.5～5.5 范圍內，有2 處異頭氫質子H-1 的化學位移。一般而言，α構型多糖分子異頭氫的化學位移δ＞5.0，β構型多糖分子異頭氫化學位移δ＜5.0[29]。這表明三種食用菌多糖既存在α構型又存在β構型，且δ5.31處的異頭氫質子化學位移指示存在D-半乳糖醛酸（α構型）。

圖3 三種食用菌多糖的1H NMR 譜圖Fig.3 1H NMR spectra of polysaccharides from three edible fungi

在圖4 中，三種食用菌在δ103.00 附近含有一個異頭碳信號，這是β糖苷鍵的典型信號峰。觀察到被O 取代的C-6 的信號峰在δ68.83 附近，未取代的C-6 的信號峰處于δ60.71 附近，說明可能存在β-（1→6）-D-吡喃葡萄糖。δ71 附近為α構型C-2，C-3的吸收峰。δ73.04 處是（1→6）糖苷鍵中的C-5。三種食用菌多糖的核磁共振分析進一步驗證紅托竹蓀的邊角廢料菌托的多糖與可食用的食用菌多糖具有相似的結構，為其代替昂貴的食用菌原料生產多糖提供參考依據。

圖4 三種食用菌多糖的13C NMR 譜圖Fig.4 13C NMR spectra of polysaccharides from three edible fungi

2.6 剛果紅實驗結果分析

根據三種食用菌多糖的最大吸收波長與剛果紅溶液的相比是否發生紅移判斷三種食用菌多糖是否具有三重螺旋結構[30]。如圖5所示，三種食用菌多糖的最大吸收峰與對照組相比發生紅移，說明香菇、黑木耳和紅托竹蓀菌托多糖中存在三螺旋結構，與剛果紅絡合后在NaOH 作用下發生一定的紅移。

圖5 三種食用菌多糖剛果紅實驗結果Fig.5 Experimental results of congo red polysaccharide from three edible fungi

2.7 三種食用菌多糖抗氧化活性結果比較

通過測定三種食用菌多糖的DPPH 和羥基自由基的清除率，以及對Fe3+總還原力來判定它們的抗氧化能力。從圖6 可以看出，三種食用菌多糖在實驗濃度范圍內，清除DPPH、OH 自由基和還原Fe3+的能力均隨著濃度的增加而增加。當濃度為1.0 mg/mL時，香菇、黑木耳和紅托竹蓀菌托多糖對DPPH 自由基的清除率依次為59.84%、9.88%和66.86%，對DPPH 自由基的清除能力的IC50值依次為0.055、0.180 和0.010 mg/mL，紅托竹蓀菌托多糖對DPPH的清除率極顯著高于香菇和黑木耳多糖（P＜0.01）。當濃度為3.0 mg/mL 時，香菇、黑木耳和紅托竹蓀菌托多糖對Fe3+總還原力分別為0.926、0.1552 和0.5958，對Fe3+總還原力的IC50值依次為1.214、1.455 和1.217 mg/mL，香菇和紅托竹蓀菌托多糖對Fe3+總還原力極顯著高于黑木耳多糖（P＜0.01），但香菇多糖與紅托竹蓀菌托多糖組間無顯著性差異（P＞0.05）。當濃度為3.0 mg/mL 時，香菇、黑木耳和紅托竹蓀菌托對OH 自由基的清除率分別為27.70%、12.91%和35.69%，對OH 自由基的清除能力的IC50值依次為0.350、0.456 和0.195 mg/mL，紅托竹蓀菌托對OH自由基的清除率極顯著高于香菇和黑木耳（P＜0.01）。綜合DPPH 和羥基自由基的清除率，以及對Fe3+總還原力實驗結果來看，紅托竹蓀菌托多糖的抗氧化能力最佳，香菇多糖次之，黑木耳多糖最差。三種食用菌多糖的抗氧化能力差異較大，可能是由于種類差異或部分結構組成不同造成的。

圖6 三種食用菌多糖抗氧化能力實驗Fig.6 Antioxidant capacity of polysaccharides from three edible fungi

3 結論

多糖的結構對其生物活性有很大的影響，因此本研究分別對香菇、黑木耳和紅托竹蓀菌托中多糖的結構進行了測定，對比了三種食用菌多糖的抗氧化能力。通過Sevag 脫蛋白和透析后紅托竹蓀托的多糖具有較好的均一性，三種多糖分子量均分布在萬級和百萬級。通過紅外和核磁共振檢測出三種食用菌多糖是具有三螺旋結構且含有相似的官能團的α和β構型的酸性多糖，三種食用菌多糖基本結構無顯著性差異。此外，三種食用菌多糖都具備抗氧化活性，其中紅托竹蓀菌托多糖的抗氧化能力最佳，香菇多糖次之，黑木耳多糖最差。紅托竹蓀的菌托作為邊角廢料往往在采摘過程中被去掉丟棄造成浪費，就抗氧化活性上，可將其利用于抗氧化食品和藥品的開發中，后續可研究其他的生物活性，代替昂貴的食用菌多糖產品，具有良好發展和應用前景。