小鼠肺炎病毒RT-PCR方法的建立及在實驗動物感染和國際比對樣本檢測中的應用*

王 吉 王莎莎 王淑菁 李 威 秦 驍 李曉波 付 瑞 岳秉飛 賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 102629)

小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice，PVM)屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺炎病毒屬(pneumovirus)，核酸型為單股RNA，是嚙齒類動物中最常見的病毒之一[1]。PVM 呈世界范圍性分布，廣泛存在于小鼠和大鼠群中。PVM呈嚴格的嗜肺性，主要經呼吸道傳播。實驗動物中自然宿主為小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等嚙齒類動物。兔、猴、黑猩猩和人也能感染。動物感染后表現食欲下降、被毛粗亂、消瘦、呼吸急促等癥狀, 不僅會對實驗動物本身造成危害，還會對吸入毒理學、肺細胞動力學、代謝學以及免疫學等實驗研究產生干擾[1-2]。Madarame等[3]從疑似為刺猬搖擺綜合征(WHS)的患病非洲刺猬(Atelerixarbiventris)體內檢到PVM病原體，說明PVM宿主范圍在擴大。

本研究旨在建立簡便、快速RT-PCR檢測方法，用于小鼠、大鼠、沙鼠等實驗動物及其相關樣本的快速檢測。為實驗動物的質量控制及實驗動物疾病的快速診斷提供必要、可靠的檢測技術手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病毒及實驗動物樣本：小鼠肺炎病毒(PVM)：美國ATCC(編號：VR-25)；漢坦病毒(hantavirus，HV)、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、仙臺病毒(sendai virus，SV)、呼腸孤病毒3型(reovirus type 3，Reo3)及不同代次PVM細胞毒：本室保存。5只長爪沙鼠、7只清潔級小鼠肺組織樣本：國內某送檢單位；9只SPF大鼠、20只SPF小鼠和19只PVM感染SPF小鼠肺組織樣本：中國食品藥品檢定研究院動物生產供應室提供【SCXK(京)2017-0005】【SYXK(京)2017-0013】。本實驗按照中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利倫理審查委員會的相關規定進行實驗，倫理委員會審批號：中檢動(福)第2019(A)001。

1.1.2主要試劑及儀器：RNA快速提取試劑盒：德國QIAGEN公司；逆轉錄試劑盒：Thermo公司；TaqHS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10×PCR buffer、100 bp DNA Marker：寶生物工程(大連)有限公司；pGEM T Easy質粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀：美國Bio-RAD公司MYCYCLER；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-RAD公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國Kodak公司 GL212Pro。

1.2 方法

1.2.1引物的設計及合成：比較分析已報道的不同株PVM G基因序列，根據GenBank中登錄的PVM毒株(序列號：AY729016)G基因序列選擇保守區域作為靶基因，用Primer Premier 6.0軟件設計兩組引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成(表1)。

表1 引物序列及位置Table 1 The primer sequence and position

1.2.2毒種的處理：取ATCC PVM毒種用DMEM進行10倍稀釋，一部分用于病毒RNA提取，一部分凍存于-70 ℃冰箱保存。

1.2.3病毒RNA提取：取正常BHK21細胞凍存液、10倍稀釋ATCC PVM毒種、HV、LCMV、SV、Reo3細胞毒各0.2 mL作為模板，按照RNA提取試劑盒操作方法進行RNA提取。提取的RNA樣本立即進行cDNA合成。

1.2.4反轉錄：通過對隨機引物及AMV逆轉錄酶濃度進行優化，確定反轉錄體系為：5×RNA PCR Buffer 5 μL、dNTPs Mixture 4 μL、RNase Free dH2O 5.5 μL、隨機引物1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、 AMV反轉錄酶0.5 μL、病毒RNA 8 μL，反應條件為：37 ℃ 90 min、42 ℃孵育15 min、95 ℃ 5 min,獲得cDNA,保存備用[4-5]。

1.2.5PCR方法反應體系及反應條件的確定：以10倍稀釋ATCC PVM毒種 cDNA為模板進行PCR擴增。對2組引物PCR反應體系的10×Buffer濃度、dNTPs濃度、TaqHS酶濃度、引物、模板量，及反應體系的退火溫度及循環次數等進行優化，通過對正常BHK細胞、PVM毒種進行PCR擴增來確定RT-PCR反應的最佳反應模式[4-5]。

1.2.6PCR擴增產物的檢測：取5 mL 擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE (0.04 mol/L Tris乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)，110 V電泳40 min，在紫外成像儀下觀察PCR產物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder Marker為參照物，判定結果。RT-PCR陽性擴增片段進行測序，通過與GenBank 中PVM序列進行比對以確定PCR檢測的準確性[4-5]。

1.2.7特異性試驗：用建立的RT-PCR方法同時檢測PVM、HV、LCMV、SV、Reo3及BHK21細胞，以驗證建立方法的特異性。

1.2.8敏感性試驗：(1) PVM病毒濃度梯度檢測。取感染滴度為104.75/mL PVM病毒液，用PBS做系列倍比稀釋，分設10-1～10-99個不同濃度梯度。取每個稀釋度病毒液各0.2 mL制備模板，用所設計的2組引物進行RT-PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測病毒最小滴度。

(2)PVM DNA質粒濃度梯度檢測。將起始濃度為 8.77×107copies/μL PVM質粒做倍比稀釋，分設8.77×107～8.77×100copies/μL 8個不同濃度梯度進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能擴增的最小DNA質粒模板濃度。

1.2.9重復性和穩定性試驗：將8.77×106～8.77×104copies/μL 3個濃度梯度PVM質粒和同一批PCR檢測試劑于-30 ℃冰箱放置12個月后，進行PCR檢測。每個濃度梯度質粒各做3個重復。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[5]。

1.2.10方法的應用：(1)對日常送檢部分小鼠、大鼠和沙鼠的檢測。取日常送檢的清潔級長爪沙鼠5只、2個品系SPF大鼠9只、4個品系SPF小鼠20只和1個品系清潔級小鼠7只肺組織樣本進行研磨，用無菌PBS震蕩懸浮，5 000 r/min離心30 min，取上清用引物2建立的方法進行檢測。檢測的陽性樣本，需要進行測序，并將測序結果與GenBank中PVM核酸序列進行比對，以驗證檢測結果的準確性。送檢動物具體信息見表2。

表2 肺組織樣本來源動物信息Table 2 The information of testing lung tissue samples

(2)對感染小鼠的檢測。用引物2 建立的方法檢測人工感染小鼠：為驗證方法的可應用性及初步探索PVM對小鼠的感染性，實驗通過滴鼻方式人工感染4周齡SPF NIH小鼠19只，劑量為0.06 mL/只。分別于感染后第3、5、7、9、14、18天取小鼠肺組織樣本，除第9天取樣4只外，其他時間均取樣3只。取樣結束，對19只人工感染的小鼠肺組織樣本進行研磨處理后，用引物2建立的方法檢測。取樣時間和對應的樣本編號信息見表3。

表3 取樣時間和對應的樣本編號信息Table 3 The information of sampling time and corresponding sample number

(3)可信度驗證。用本實驗室建立的PVM熒光定量PCR方法,檢測19只人工感染小鼠肺組織樣本，驗證用引物2建立PCR方法的可信度。Q-PCR方法用引物和探針見表4。

表4 熒光定量PCR方法所用引物和探針Table 4 The primers and probes for fluorescence quantitative PCR method

(4)用于ICLAS國際比對樣本的檢測。利用引物2建立的方法對2016—2019年連續4年ICLAS組織的國際比對大小鼠易感待檢RNA病毒樣本和未知RNA或DNA病毒樣本進行檢測。樣本具體信息見表5。

表5 ICLAS診斷實驗室能力評估程序樣本分布Table 5 ICLAS diagnostic laboratory performance evaluation program specimen distribution

2 結果

2.1 反應體系及反應條件的確定

以10倍稀釋ATCC PVM毒種 cDNA為模板用2組引物進行PCR擴增。反應體系為：10×ExTaqBuffer(Mg2+Free) 2 μL, dNTPs Mixture(10 mmol/L)2 μL,TaqHS酶(5 U/μL)0.5 μL,上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，cDNA 2 μL，補水至20 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環；72 ℃再延伸5 min。均有明顯的目的條帶產生(圖1和圖2)。2組引物擴增產物測序結果與GenBank 中PVM標準株序列進行比對，核苷酸序列同源性均為99%。

圖1 引物1擴增PVM電泳結果M：100 bp DNA marker；1：PVM;2:BHK21細胞Fig.1 The electrophoresis results of primer 1 amplified PVMM:100 bp DNA marker;1:PVM;2:BHK21 cells

圖2 引物2擴增PVM電泳結果M：100 bp DNA marker；1：PVM;2:BHK21細胞Fig.2 The electrophoresis results of primer 2 amplified PVMM:100 bp DNA marker;1:PVM;2:BHK21 cells

2.2 特異性試驗

用2組引物同時檢測PVM、HV、LCMV、SV、Reo3及BHK21細胞，電泳結果顯示除PVM產生目的條帶外，其他4種病毒和BHK21細胞均無目的條帶產生(圖3和圖4)。說明2組引物特異性均良好。

圖3 引物1特異性試驗電泳結果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2～6：BHK21細胞、HV、LCMV、SV、Reo3Fig.3 The electrophoresis results of primer 1 specific testM:100 bp DNA marker;1:PVM;2～6:BHK21 cells,HV, LCMV, SV, Reo3

圖4 引物2特異性試驗電泳結果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2～6：BHK21細胞、HV、LCMV、SV、Reo3Fig.4 The electrophoresis results of primer 2 specific testM:100 bp DNA marker;1:PVM;2～6:BHK21 cells,HV,LCMV,SV,Reo3

2.3 敏感性試驗

2.3.1PVM病毒濃度梯度檢測：用2組引物檢測感染滴度為104.75/mL不同濃度梯度的病毒，結果顯示引物1和引物2所能檢測的最小濃度梯度病毒分別為10-3和10-4(圖5和圖6)。

圖5 引物1病毒濃度梯度檢測結果M：100 bp DNA marker；1～9：10-1～10-9濃度梯度病毒Fig.5 The detection results of primer 1 for virus concentration gradientM:100 bp DNA marker;1～9:10-1～10-9 dilution concentration gradient virus

圖6 引物2病毒濃度梯度檢測結果M：100 bp DNA marker；1～9：10-1～10-9 濃度梯度病毒Fig.6 The detection results of primer 2 for Virus concentration gradientM:100 bp DNA marker;1～9:10-1 ～10-9 dilution concentration gradient virus

2.3.2PVM DNA質粒濃度梯度檢測：用2組引物檢測8.77×107L～8.77×100copies/μL 8個不同濃度梯度的質粒，結果顯示引物1和引物2所能檢測到的病毒質粒最小濃度分別為8.77×103copies/μL和8.77×102copies/μL(圖7和圖8)。

圖7 引物1質粒濃度梯度檢測結果M：100 bp DNA marker；1～8：8.77×107 ～8.77×100 copies/μL質粒；Fig.7 The detection results of primer 1 for plasmids concentration gradientM:100 bp DNA marker；1～8:8.77×107 ～8.77×100 copies/μLconcentration gradient plasmids

圖8 引物2質粒濃度梯度檢測結果M：100 bp DNA marker；1～8：8.77×107 ～8.77×100 copies/μL質粒；Fig.8 The detection results of primer 2 for plasmids concentration gradientM:100 bp DNA marker;1～8:8.77×107 L～8.77×100 copies/μL concentration gradient plasmids

通過2組引物病毒濃度梯度和質粒濃度梯度的敏感性檢測結果，說明引物2檢測靈敏度更高。因此實驗選擇引物2作為方法建立檢測用引物。

2.4 重復性和穩定性試驗

用引物2進行重復性和穩定性試驗，結果顯示引物2上下游引物、檢測試劑及8.77×104～8.77×106copies/μL 3個濃度梯度PVM質粒放置于-30 ℃冰箱12個月后，依然能擴增到明顯的目的條帶(圖9)。說明建立的方法重復性良好，穩定性至少可達12個月。

圖9 引物2重復性及穩定性試驗結果M：100 bp DNA marker；1～3：8.77×106 copies/μL質粒；4～6：8.77×105 copies/μL質粒；7～9：8.77×104 copies/μL質粒Fig.9 The repeatability and stability test results of primer 2M:100 bpDNAmarker;1～3:8.77×106 copies/μL plasmids;4～6:8.77×105 copies/μL plasmids;7～9:8.77×104 copies/μL plasmids

2.5 方法的應用

2.5.1對小鼠、大鼠和沙鼠的檢測：用引物2建立的方法檢測5只清潔級長爪沙鼠、9只SPF大鼠、20只SPF小鼠和7只清潔級小鼠，電泳結果顯示，均無約249 bp目的條帶產生。檢測結果均為陰性(圖10和圖11)。

圖10 引物2檢測5只沙鼠(G1～G5)、7只清潔級小鼠(M1～M7)和5只SPF小鼠(M8～M12)肺組織樣本電泳結果M：100 bp DNA marker；1和15：PVM；2和16：BHK21cells；3～7：G1～G5；8～14：M1～M7；17～21：M8～M12；Fig.10 The electrophoresis results of primer 2 for detection lung tissue samples of 5 gerbils(G1～G5),7 clean mice(M1 ～ M7) and 5 SPF mice(M8-M12)M:100 bp DNA marker;1 and 15:PVM;1and 16:BHK21cells;3～7:G1～G5;8～14:M1～M7;17～21:M8～M12

圖11 引物2檢測15只SPF小鼠(M13～M27)和9只SPF大鼠(R1～R9)肺組織樣本電泳結果M：100 bp DNA marker；1～15：M13～M27；16～24：R1～R9Fig.11 The electrophoresis results of primer 2 for detection lung tissue samples of 15 SPF mice(M13-M27)and 9 SPF rats(R1～R9)M:100 bp DNA marker;1～15:M13～M27;16～24:R1～R9

2.5.2對感染小鼠的檢測：(1)用引物2建立的PCR方法檢測人工感染小鼠結果。對表3中人工感染19只SPF 小鼠進行檢測，結果顯示IM1、IM2、IM7、IM8、IM10、IM12、IM13號小鼠肺組織有約249 bp明顯目的條帶產生,電泳結果見圖12。7個樣本擴增產物測序結果與PVM標準株核苷酸序進行比對同源性均為99%。19只小鼠感染率為36.8%(7/19)。

圖12 引物2檢測19只人工感染小鼠肺組織樣本電泳結果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2：BHK21 cells；3～21：IM1～IM19；Fig.12 The electrophoresis results of primer 2 for detection 19 lungtissue samples of artificially infected mice(IM1～IM19)M：100 bp DNA marker;1:PVM;2:BHK21 cells;3～21:IM1～IM19

(2)可信度驗證。用本研究建立的PVM熒光定量PCR(q-PCR)方法檢測表3中人工感染的19只小鼠肺組織樣本。在陰陽對照成立的條件下，結果顯示有7只小鼠肺組織樣本有明顯的擴增曲線，PVM核酸陽性，陽性小鼠編號分別為IM1、IM2、IM7、IM8、IM10、IM12、IM13號。其他編號小鼠肺組織樣本均無擴增曲線產生，結果均為陰性。19只小鼠q-PCR擴增曲線見圖13，結果陽性的7只小鼠肺組織樣本檢測結果見表6。

表6 q-PCR檢測7只陽性小鼠肺組織樣本結果Table 6 The results of q-PCR detection for 7 positive mice lung tissue samples

圖13 q-PCR檢測19只人工感染小鼠肺組織樣本擴增曲線圖 1：P/C；2-21：N/C 和IM1～IM19Fig.13 The amplified graph of lung tissue samples from 19 artificially infected mice were detected by q-PCR1：P/C; 2-21：N/C 和IM1～IM19

從檢測結果看，用引物2建立的PCR方法和本室q-PCR方法同時檢測19只人工感染小鼠肺組織樣本，IM1、IM2、IM7、IM8、IM10、IM12、IM13結果均為陽性，其他12個樣本均為陰性，2種方法檢測結果符合率為100%。

2.5.3用于ICLAS國際比對樣本的檢測：利用建立的方法對2016—2019年連續4年ICLAS組織的國際比對待檢RNA病毒樣本和待檢未知RNA或DNA病毒樣本進行檢測。結果顯示2016—2019年的5個待檢RNA病毒樣本和2018年的1個待檢未知RNA或DNA病毒樣本，PVM檢測結果均為陰性。電泳結果圖均略。

2019年2個RNA病毒樣本52-6、52-8經引物2建立的方法檢測，電泳結果顯示2個樣本均有約249 bp目的條帶產生，電泳結果見圖14。2個樣本擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果通過NCBI BLAST與GenBank 中PVM序列進行比對(圖15)，結果顯示52-8為非特異擴增到的小鼠基因組。52-6樣本為特異性擴增，且與GenBank中PVM標準株核苷酸序列同源性為100%。經驗證確定52-6樣本為小鼠肺炎病毒，與ICLAS預期結果一致。

圖14 引物2檢測ICLAS實驗室能力評估樣本52-6、52-8電泳結果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2：BHK21 cells；3：52-6；4：52-8Fig.14 The electrophoresis results of primer 2 for detection laboratory performance evaluation specimens 52-6 and 52-8 provided by ICLAS

2個樣本擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果通過NCBI BLAST與GenBank 中PVM序列進行比對(圖15)，結果顯示52-8為非特異擴增到的小鼠基因組。52-6樣本為特異性擴增，且與GenBank 中PVM標準株核苷酸序列同源性為100%。經驗證確定52-6樣本為小鼠肺炎病毒，與ICLAS預期結果一致。

圖15 ICLAS能力評估樣本52-6擴增產物與PVM標準株比對結果Fig.15 The comparison results of amplification products of ICLAS performanceevaluation specimen 52-6 with PVM standard strains

3 討論

PVM于1940年由Hor-sfall和Hahn首次分離[7]，吳惠英等[8]在我國首次分離得到1株鼠肺炎病毒。PVM在實驗小鼠中感染該病毒比較普遍, 美國的實驗鼠群中有50%被感染，吳惠英等[8]調查了實驗鼠群中PVM抗體, 證實與國外報道一致。趙雅靜等[2]對開放飼養鼠群中50份小鼠血清樣本行檢測，PVM感染率30%；王吉等[9]對2003～2007年我國實驗小鼠病毒抗體檢測結果進行統計，發現PVM抗體陽性率為0.51%。葛文平等[10]檢測不同廠家SPF小鼠，結果顯示PVM抗體陽性率為3.125%。吳瑞可等[11]對廣東省2014—2016年普通級豚鼠進行病毒抗體監測,發現普通級豚鼠PVM抗體陽性率為20%。以上結果均說明PVM在我國嚙齒類實驗動物群中依然廣泛存在。

同時PVM不僅是實驗動物國家標準SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等實驗動物及沙鼠地方標準要求的必檢項目之一[12-14]，也是《中國藥典》2020年版 三部“生物制品生產及檢定用實驗動物質量控制”要求生物制品生產用和檢定用SPF小鼠、生物制品生產用SPF地鼠、生物制品生產用長爪沙鼠、生物制品檢定用SPF豚鼠要求必須排除的項目[15]，而且還是ICLAS國際實驗室能力評價大小鼠檢測項目范圍之內的病毒項目。因此PVM的監測在嚙齒類實驗動物質量控制中依然重要。

本研究建立的PVM RT-PCR方法特異性試驗結果顯示與同科的SV和嚙齒類實驗動物易感的與HV、LCMV、Reo3均無交叉反應；敏感性結果顯示檢測最小DNA模板濃度可達8.77×102拷貝/μL；穩定性試驗結果顯示方法穩定性至少可達12個月；說明建立的方法特異、敏感、穩定、可靠。在可應用性方面，(1)用建立的方法檢測日常送檢測的27只小鼠(7只清潔級小鼠和20只SPF級小鼠)、9只大鼠(SPF級)、5只沙鼠(清潔級)肺組織樣本結果均為陰性，實驗室同時采用ELISA方法對同41只動物進行PVM抗體檢測，結果均為陰性。說明上述動物確實無PVM感染。(2)用建立的方法檢測19只滴鼻感染的小鼠，擴增的陽性產物經測序驗證證明1、2、7、8、10、12、13號小鼠PVM檢測結果為陽性；為驗證方法的可信度，以避免假陰性結果的出現，實驗同時用q-PCR 方法檢測了19只人工感染的小鼠肺組織樣本，結果顯示2種方法檢測結果符合率為100%，說明建立的方法檢測結果準確可靠。從檢測結果看，動物在感染后第3、7、9天時能從肺組織內檢測到病毒，在感染后第5、14、18天未檢測到病毒。至于PVM在動物體內感染和存在的規律還有待進一步研究。(3)用建立的方法對2016—2019年ICLAS組織的國際比對大鼠、小鼠易感待檢RNA病毒樣本和未知RNA或DNA病毒樣本進行檢測，通過電泳結果及對擴增產物進行測序驗證，證明只有2019年52-6樣本為PVM，與ICLAS提供的預期結果相符。說明建立的方法特異、敏感、檢測結果可靠，可用于動物、動物感染樣本和國際比對樣本的檢測。

PCR技術以其簡便、快速、特異、敏感及可通過對產物進行測序驗證防止假陽性結果出現的特點，依然是臨床檢驗及實驗室檢測的一種可靠手段。雖然國內已有PVM核酸檢測方法建立的相關報道[16]，但均沒有推廣應用。本研究建立的PVM PCR方法不僅可以作為實驗室的技術資源儲備用于實驗動物監測及相關樣本的檢測，也為試劑盒的研制及技術的推廣應用奠定了基礎。