實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)*

馮育芳 邢 進(jìn) 王 洪 張雪青 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)可產(chǎn)生耐熱腸毒素，不能被高溫滅菌(121 ℃、30 min)破壞，對(duì)酸堿穩(wěn)定。食用被該菌污染的食物、水，以及與感染動(dòng)物接觸，可導(dǎo)致人獸共患病，甚至造成死亡[1-2]。因此，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌屬于SPF級(jí)動(dòng)物必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目[3]。為了解和提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)能力，本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目依據(jù)CNAS-CL03《能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》進(jìn)行檢測(cè)能力驗(yàn)證(NIFDC-PT-173)，以期對(duì)提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)能力[4]提供參考，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃的實(shí)施提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雌性豚鼠2只，8周齡，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供【SYXK(京)2017-0012】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理號(hào)：中檢動(dòng)(福)第2021(A)007號(hào)。動(dòng)物糞便采集在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1.1.2菌株：本研究使用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica, CMCC52301)，同時(shí)設(shè)置2個(gè)干擾菌；根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和特征，選擇宋內(nèi)志賀氏菌(Shigellasonnei, CMCC51082)和大腸埃希氏菌(Escherichiacoli, CMCC44110)。3株菌均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，使用前通過(guò)BD-Phoniex100細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.1.3試劑材料：凍干保護(hù)液由中國(guó)食品藥品檢定研究院食品化妝品所提供。培養(yǎng)基包括哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)(OXIOD公司，CM0331B)、脫纖維羊血(北京陸橋公司，P62)、CIN-1培養(yǎng)基(海博生物，HB0269)和改良Y培養(yǎng)基(海博生物，HB0270)；生化鑒定試劑為BD陰性菌鑒定板(BD公司，448007)。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)控樣品制備：復(fù)蘇小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、宋內(nèi)志賀氏菌和大腸桿菌，在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，25 ℃培養(yǎng)48 h后分別用PBS調(diào)成109CFU/mL的菌懸液備用。將80%的凍干保護(hù)液、10%的SPF豚鼠糞便(高壓滅菌后)和10%的菌懸液(109CFU/mL)震蕩混勻制成混懸液，細(xì)菌終濃度為108CFU/mL，將3種混懸液進(jìn)行分裝(200 μL/管)，用冷凍干燥機(jī)制成凍干樣品。樣品采用大流水方式進(jìn)行編號(hào)。

1.2.2質(zhì)控樣品均勻性試驗(yàn)：在3種樣品中分別隨機(jī)抽取10管樣品，用200 μL滅菌水重懸，10倍系列稀釋至102CFU/mL，將102～104CFU/mL濃度的菌液接種改良Y瓊脂，25 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，菌液濃度相差應(yīng)低于100倍，即原始菌液濃度應(yīng)在106～108CFU/mL之間。

1.2.3質(zhì)控樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)：本次能力驗(yàn)證的3種質(zhì)控樣品進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，首先對(duì)貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)，于-20 ℃、4℃、25 ℃、37 ℃保存。-20 ℃于0 、30 d時(shí)取樣，4 ℃于0、14、21、28 d取樣(25±1)℃、37 ℃于0～10 d每天取樣，參照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)對(duì)上述抽取樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。用200 μL滅菌水重懸將菌液接種改良Y瓊脂，25 ℃培養(yǎng)48 h，3種樣品可分別檢測(cè)出相應(yīng)的細(xì)菌。同時(shí)對(duì)運(yùn)輸穩(wěn)定性進(jìn)行檢驗(yàn)，選取不同溫度條件的城市，將樣品完全按照實(shí)際運(yùn)輸要求進(jìn)行包裝，分別寄往相應(yīng)城市后再寄回，應(yīng)能檢出相應(yīng)細(xì)菌。

1.2.4參加實(shí)驗(yàn)室：全國(guó)共24家實(shí)驗(yàn)室參加了此次能力驗(yàn)證計(jì)劃，地區(qū)分布見(jiàn)表1。

表1 參加實(shí)驗(yàn)室地區(qū)分布Table 1 Local distribution of Laboratory

1.2.5檢測(cè)方法：本次能力驗(yàn)證建議參考GB/T 14926.3—2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耶爾森菌檢測(cè)方法。不局限于國(guó)標(biāo)規(guī)定檢測(cè)方法，但要求提供原始記錄，并要求含有具體檢測(cè)信息。

1.2.6結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：3種樣品中1個(gè)為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽(yáng)性，2個(gè)為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陰性。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與上述結(jié)果完全一致，即判定為滿意結(jié)果；實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與上述結(jié)果不一致，即判定為不滿意結(jié)果；未按時(shí)反饋結(jié)果，也判定為不滿意結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控樣品均勻性試驗(yàn)

隨機(jī)選取10套樣品用于均勻性驗(yàn)證，所有樣品在相同環(huán)境下對(duì)所含細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行平板計(jì)數(shù)測(cè)定。3種樣品測(cè)定結(jié)果為：CMCC52301濃度 8.99×107～3.48×108CFU/mL，CMCC51082濃度 9.20×107～3.98×108CFU/mL。CMCC44110濃度 7.65×107～2.98×108CFU/mL。表明本次能力驗(yàn)證所制備的樣品是均勻的。

2.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.2.3的方法對(duì)所制備的能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行溫度和運(yùn)輸穩(wěn)定性測(cè)試，4 ℃存儲(chǔ)4周，室溫(25±1)℃和37 ℃放置10 d，3種樣品均能檢出相應(yīng)細(xì)菌。運(yùn)輸穩(wěn)定性檢驗(yàn)證實(shí)樣品可以滿足運(yùn)輸要求，并保持細(xì)菌活性。存放穩(wěn)定性和運(yùn)輸穩(wěn)定性結(jié)果證明了所制備能力驗(yàn)證樣品的穩(wěn)定性達(dá)到發(fā)放要求。

2.3 實(shí)驗(yàn)室反饋

參加此次比對(duì)共24個(gè)實(shí)驗(yàn)室，22家滿意，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的91.7%；2家不滿意，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的8.3%，其中1家未及時(shí)反饋結(jié)果，另一家將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陰性樣品檢測(cè)為陽(yáng)性。本次能力驗(yàn)證不公布具體實(shí)驗(yàn)室名稱，僅以實(shí)驗(yàn)室代碼進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢出能力驗(yàn)證結(jié)果匯總Table 2 The summarizing of the detection levels of experimental animal Yersiniaenterocolitica testing results

3 討論

CNAS-RL01: 2018《實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可規(guī)則》、CNAS-RL02: 2018《能力驗(yàn)證規(guī)則》規(guī)定申請(qǐng)認(rèn)可和獲準(zhǔn)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室必須通過(guò)參加能力驗(yàn)證活動(dòng)(包括CNAS組織實(shí)施或承認(rèn)的能力驗(yàn)證計(jì)劃、測(cè)量審核)證明其技術(shù)能力。只有在能力驗(yàn)證活動(dòng)中表現(xiàn)滿意，或?qū)τ诓粷M意結(jié)果能證明已開(kāi)展了有效糾正措施的實(shí)驗(yàn)室，CNAS方可受理認(rèn)可申請(qǐng)或予以認(rèn)可。對(duì)參加了CNAS組織及其承認(rèn)的能力驗(yàn)證活動(dòng)且有穩(wěn)定滿意表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)室，在CNAS的各類評(píng)審中可考慮適當(dāng)簡(jiǎn)化相關(guān)項(xiàng)目的能力確認(rèn)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存上述記錄以備評(píng)審組檢查。

能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量監(jiān)控的重要手段，既是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的補(bǔ)充，又是政府和社會(huì)了解實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要方法[5]。能力驗(yàn)證作為日常監(jiān)督檢查的輔助手段，能夠有效提升實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室保持有效的檢測(cè)能力，同時(shí)也幫助部分實(shí)驗(yàn)室及時(shí)發(fā)現(xiàn)自身的不足并加以改進(jìn)，為更好地檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供有力的技術(shù)支撐[6-7]。本項(xiàng)目研究，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森菌能力驗(yàn)證樣品的制備、評(píng)價(jià)方案的制定以及能力驗(yàn)證結(jié)果的匯總分析，評(píng)價(jià)參加單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病菌的檢測(cè)能力，驗(yàn)證計(jì)劃的組織和實(shí)施工作。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)程序?yàn)椋簾o(wú)菌操作下取回盲部?jī)?nèi)容物、糞便或肛拭子，接種于CIN-1或改良Y瓊脂平皿，置25 ℃培養(yǎng)48 h，觀察平皿上是否有邊緣半透明或透明，中心呈深紅色，表面濕潤(rùn)突起的“牛眼狀”菌落，如有可疑菌落，需要純培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定，生化鑒定可以選擇全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，也可以選擇生化條，或者根據(jù)國(guó)標(biāo)中的生化項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)均可以得出準(zhǔn)確的結(jié)論。

從NIFDC-PT-173實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃結(jié)果報(bào)告中可以看出，本次能力驗(yàn)證計(jì)劃參加實(shí)驗(yàn)室共有24家，其中23家實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)間內(nèi)提交了結(jié)果反饋單，1家沒(méi)有及時(shí)提交結(jié)果反饋單。其中判定為滿意結(jié)果的有22家，占91.7%，不滿意結(jié)果有2家，占8.3%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)能力很高。本次能力驗(yàn)證不規(guī)定檢測(cè)方法，參加單位中有6家采用了不止2種檢測(cè)方法，有2家單位使用了PCR方法進(jìn)行檢測(cè)并準(zhǔn)確的檢測(cè)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，20家均采用了生化鑒定法，實(shí)驗(yàn)室449未及時(shí)反饋結(jié)果，判為不滿意，實(shí)驗(yàn)室887將陰性樣本檢測(cè)為陽(yáng)性，判為不滿意，查驗(yàn)了該單位的檢測(cè)報(bào)告，考慮可能是因?yàn)槌醮谓臃N樣本時(shí)污染或接錯(cuò)等導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。

本次能力驗(yàn)證活動(dòng)采用生化鑒定的單位中有9家沒(méi)有生化管來(lái)源及批號(hào)信息，要求檢測(cè)報(bào)告中應(yīng)含有完整的試劑信息。在參加單位中，有2家單位寄回的紙質(zhì)材料中沒(méi)有原始記錄，所以無(wú)法判斷這2家單位用的何種檢測(cè)方法。除去能力驗(yàn)證的要求，附原始記錄對(duì)參加單位是有好處的，比如結(jié)論填報(bào)錯(cuò)誤但原始記錄結(jié)果正確，這種情況會(huì)聯(lián)系該單位要求其改正結(jié)論，如果沒(méi)有原始記錄即只能判定該單位結(jié)果不滿意。

綜上所述，本次能力驗(yàn)證的實(shí)施有助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)自身的問(wèn)題，并且針對(duì)性的予以解決，達(dá)到提高自身檢測(cè)能力的目的，最終提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量水平，保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的安全和效果。