脂肪乳誘導SD大鼠與KM小鼠高脂血癥模型的對比研究*

孫 航 寧 瓏 方鈺發 周艷凱 馮 晉 楊瓊英 何芳雁

(云南中醫藥大學 中藥學院，昆明 650000)

高脂血癥是肥胖癥、非酒精性脂肪肝病、糖尿病、高血壓、腦中風等疾病的高危險因素[1-5]。近年來，隨著社會經濟的發展，人民生活方式的改變以及西方飲食的傳播，使得我國成年人血脂異常的總體患病率高達40.4%，并呈不斷上升趨勢[6]。他汀類藥物為HGM-CoA還原酶抑制劑，可抑制膽固醇的合成而發揮療效，臨床常用于治療高膽固醇血癥，然而其肝損傷和肌病等不良反應在一定程度上限制了他汀類藥物的應用[7-8]。因此尋找安全有效對抗高脂血癥的藥物仍具有現實意義。

降脂藥物的研究與開發需選擇適合的動物模型，動物模型是實驗研究的基礎，其建立方法應盡量吻合病程發展，并具備方法可重復、成本較低、操作簡單、便于推廣等特點[9]。目前醫藥界研究高脂血癥的動物模型有先天性模型、轉基因模型及化學誘導模型。先天性和轉基模型因來源困難、價格昂貴導致其使用范圍受限[8]。國內應用廣泛的是化學誘導模型，造模方法包含化學試劑注射法、高脂飼料喂養法、脂肪乳劑灌胃法[10]。化學試劑注射法雖操作簡單、模型復制迅速，但對動物刺激性較大，并且其形成機制與人類高脂血癥差別較大，不適用于藥物作用機制的研究[11]；高脂飲食誘導的高脂血癥模型與人類的高脂血癥形成過程類似，但存在造模時間長、動物進食個體差異較大造成模型不穩定等缺點；脂肪乳灌胃誘導的高脂血癥模型，操作簡單，模型成果復制耗時少，并且能保證動物脂質攝取量均一。綜合比較，該方法優于高脂飲食法。但目前報道的脂肪乳配方、動物選擇及造模時間無統一標準[12]。大鼠、小鼠具有成本低、易于飼養、抗病力強、易于造模、技術方法更成熟等優點。目前，國內常用其復制高脂血癥模型，但大鼠、小鼠模型之間仍存在一定差異[11]。因此，本研究進行脂肪乳灌胃誘導大鼠、小鼠高脂血癥模型的對比研究，以期為高脂血癥發病機制的研究和降脂藥物的研發提供動物疾病模型選擇的依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級的雄性SD大鼠體質量為(200±10)g，由昆明醫科大學提供，許可證號：SCXK(滇)K2020—0004；SPF級的雄性KM小鼠【體質量為(20±3)g】，由昆明醫科大學提供【SCXK(滇)K2020-0004】。按照云南中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會的相關規定進行實驗，倫理委員會審批號：R-06201984。

1.1.2試劑與耗材：膽固醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：H1926053)；丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業有限公司，批號：1907N18)；丙二醇(成都市科龍化工試劑廠，批號：2018011701)；豬膽酸鈉(北京奧博生物技術有限責任公司，批號：20181222)；高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(均為南京建成生物工程研究所，批號：03/2019)。低溫高速離心機(日本Hitachi Koki公司，型號：cf16rx)；脫水機、石蠟包埋機、石蠟切片機(均為賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號分別為：CryoStar NX50、Excelsior AS、HISTOSTATS、Microm HM)；生物顯微鏡(瑞士Tecan公司，日本NIKON公司，型號：Ci-L)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與樣品采集：雄性SD大鼠，稱重后隨機分為對照組(灌胃等體積雙蒸水)、模型組(灌胃2 mL脂肪乳/100 g體重)，每組各10只；雄性KM小鼠，稱重后隨機分為對照組(灌胃等體積雙蒸水)、模型組(灌胃0.2 mL脂肪乳/10 g體重)，每組各10只。起初，飼以每只大鼠20 g/d(小鼠5 g/d)普通飼料，第二天稱取各組所剩飼料后補齊飼料。根據各組最少進食量來控制各組動物食量。脂肪乳灌胃2周、4周后取材，取材前12 h禁食(不禁水)。各組動物在2周時進行眼底靜脈叢取血；4周時，大鼠腹部靜脈取血、小鼠采用摘眼球取血后，迅速剝離出肝臟、脾臟、腎臟，在冰生理鹽水中涮洗，濾紙拭干水分后稱重，拍照觀察肝臟的形態學變化。脂肪乳的配制參考文獻方案[13-14]，分別稱取20 g膽固醇、1 g丙硫氧嘧啶片置于乳缽中研細備用；再稱取40 g豬油(市場自購)于鍋中小火加熱烊化呈液態，少量多次地加入研細的膽固醇粉末，混勻后，加丙硫氧嘧啶粉末，充分攪拌混勻，再緩慢加20 mL吐溫-80、20 mL丙二醇，全部混勻后，再加20 mL的10%豬膽酸鈉溶液(2 g豬膽酸鈉加雙蒸水定容至20 mL)，快速研磨呈乳化狀態即可，置于密閉容器中分裝冷藏，使用前在37 ℃恒溫水浴鍋融化。每3天配置1次。

1.2.2血脂四項及肝組織TC、TG的測定：取出血樣，肝右葉、中葉加生理鹽水(肝組織∶生理鹽水=1∶9)勻漿后，分別置于低溫離心機(血4 ℃、3 000 r/min，肝組織3 500 r/min)離心10 min，取上清液備用。參照試劑盒說明書測定血清、肝組織勻漿溶液的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

1.2.3HE染色：動物肝左葉切分成兩塊，置于10%中性甲醛溶液中固定24 h。固定好的肝組織塊經流水沖洗后置于脫水機中進行脫水、透明、復蠟、包埋，而后進行連續切片(切片厚度為5 μm)。肝組織石蠟切片脫蠟、梯度乙醇溶液復水，蘇木精染色2 min、返藍，伊紅染色45 s，透明后中性樹膠封片，晾干保存。

2 結果

2.1 脂肪乳灌胃誘導大鼠、小鼠高脂血癥模型的血脂4項對比

與對照組比較，KM小鼠模型組脂肪乳灌胃2周和4周后血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量均無明顯差異；SD大鼠模型組灌胃2周后血清TC、LDL-C明顯升高(P<0.001、P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.001)，TG無明顯變化；脂肪乳灌胃4周后，血清TC、TG、LDL-C明顯升高(P<0.001、P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.001)。詳見表1。

表1 大鼠、小鼠高脂血癥模型的血脂四項對比(mmol/L，Mean±SD，N=10)Table 1 Comparison of four items of blood lipids in hyperlipidemia models of mice and rats(mmol/L，Mean±SD，N=10)

2.2 脂肪乳灌胃誘導大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝臟TC、TG對比

與對照組比較，脂肪乳灌胃4周后，昆明種小鼠模型組肝組織TC、TG無明顯差異；SD大鼠模型組肝組織TC、TG明顯升高(P<0.001、P<0.01)。詳見表2。

表2 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝脂對比 (mmol/L，Mean±SD，N=10)Table 2 Comparison of liver lipids in hyperlipidemic models in rats and mice(mmol/L，Mean±SD，N=10)

2.3 脂肪乳誘導大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病變程度對比

2.3.1脂肪乳誘導大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝臟濕重及指數變化對比：與對照組比較，脂肪乳灌胃4周后，昆明種小鼠模型組肝臟濕重、肝臟指數顯著升高(P<0.001、P<0.01)；SD大鼠模型組肝臟濕重、肝臟指數顯著升高(P<0.001)。詳見表3。

表3 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝臟濕重、指數變化對比Table 3 Comparison of changes in liver wet weight and index of hyperlipidemia models in rats and mice

2.3.2脂肪乳灌胃誘導大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病變程度對比：與對照組比較，脂肪乳灌胃4周后，KM小鼠模型組肝臟稍有腫大，顏色發黃，質地柔軟且飽滿光滑；SD大鼠模型組可見肝臟明顯腫大，顏色發黃甚至發白，質地柔軟且飽滿光滑，切面有油膩感。詳見圖1。

圖1 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病變程度對比Fig.1 Comparison of liver pathological changes between hyperlipidemia model rats and mice

2.3.3脂肪乳灌胃誘導大、小鼠高脂血癥模型的肝組織病理學變化對比：與對照組比較，脂肪乳灌胃4周后，KM小鼠模型組肝細胞排列紊亂，肝索不清晰，肝血竇狹窄，甚至消失，肝細胞體積增大，細胞核顯像清晰，細胞質淡染；SD大鼠模型組肝細胞排列紊亂，肝索不清晰，肝血竇狹窄，甚至消失，肝細胞體積增大，細胞核顯像清晰，細胞質淡染，且有明顯的脂肪空泡。詳見圖2。

圖2 大鼠、小鼠高脂血癥模型的肝組織病理改變對比Fig.2 Comparison of hepatic histopathological changes in hyperlipidemia models in rats and mice

3 討論

高脂血癥是指血漿中TG、TC、LDL-C的含量過高，HDL-C含量過低的一種全身脂代謝異常的疾病[15]。灌胃脂肪乳因外源性脂肪吸收增多，可導致血脂升高，超過肝臟對脂質的代謝能力，脂肪在肝細胞內堆積，肝脂升高，肝細胞損傷，產生脂肪泡，最終形成脂肪肝[16-17]。本實驗為綜合比較脂肪乳誘導的大、小鼠高脂血癥模型，以期獲得最佳模型復制方法，選用血脂(TG、TC、LDL-C、HDL-C)、肝脂(TG、TC)及肝臟病變程度(肝臟形態、濕重、指數、病理改變)為指標。結果表明，脂肪乳灌胃2周，KM小鼠血脂四項均無明顯變化，SD大鼠血清TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，TC還未出現明顯變化。提示，SD大鼠較早出現血脂異常。脂肪乳灌胃4周，KM小鼠可見肝組織出現輕度病理損傷，但血脂和肝脂仍無明顯變化；SD大鼠血清TG、TC、LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，并可見肝臟明顯腫大，顏色發白，肝組織病變程度較重，有明顯的脂肪空泡出現。提示，本脂肪乳配方持續灌胃4周可成功復制大鼠高脂血癥模型，而小鼠的高脂血癥模型還未復制成功，跟動物種屬、造模時間及脂肪乳配方有一定關系。梁紅峰等[18]利用脂肪乳劑(100 g/L膽固醇、200 g/L豬油、20 g/L膽酸鈉和10 g/L丙基硫氧嘧啶)連續灌胃12周成功誘導昆明種小鼠TC升高為主的單純性高脂血癥。因此，高脂血癥發病機制和降脂藥物的研發實驗可優先選用SD大鼠用該脂肪乳配方灌胃4周。若選用本實驗脂肪乳配方及昆明種小鼠為實驗動物，可在此基礎上延長造模時間，具體時間仍待進一步研究。