EV71動物模型研究進展*

吳 勇 熊 芮 范昌發

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

人腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是從加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的一種新型腸道病毒，屬微RNA病毒科，是一種嗜神經性病毒[1]。EV71主要感染5歲以下的兒童和幼兒，可以引起手足口病(hand foot mouth disease，HFMD)[2]。自1957年首次在加拿大發現HFMD后，在全球多地尤其是在環太平洋亞洲地區頻繁爆發[3]。我國從1981年在上海首次出現[4]，隨后迅速蔓延至全國大部分地區。其中，安徽省阜陽市2008年大規模爆發HFMD，給社會造成極大的負擔[5-6]。2008年我國正式將HFMD列為丙類傳染病至今，HFMD病例數一直居于丙類傳染病之首。

HFMD的發生與包括EV71在內的20多種病毒有關，大多數HFMD患者為普通型病例，部分EV71和柯薩奇病毒A16 型(CoxA16)引起的病癥較重，可迅速引發嚴重的全身性神經系統疾病，引起后遺癥甚至死亡[7]。目在臨床上，手足口病尚無有效的預防和治療藥物，而疫苗則成為有效的防控手段。現階段，我國針對EV71的疫苗研究越來越多，篩選更合適的EV71毒株，更好的評價EV71疫苗，是當前研究的重點，而缺乏合適的動物模型嚴重制約著EV71疫苗的研制[8-9]。

良好的動物模型，需要滿足能夠支持病毒在體內復制，有一段易感時期，能夠表現出與人類相似的發病癥狀。EV71感染致死病例的變化主要表現在種屬神經系統不同部位的炎癥病變，在非人靈長類以及嚙齒類動物的研究中，都發現了相同的變化[10]。

1 非人靈長類模型

建立EV71非人靈長類動物最常用的是恒河猴和食蟹猴。這兩種動物通過灌胃、皮下注射、顱內注射等攻毒方式，均可以感染EV71。

研究發現新生恒河猴在感染EV71后與人類有非常相似的癥狀表現[10]。采用不同的感染方式對恒河猴攻毒EV71，發現顱內攻毒可導致肺水腫和出血，靜脈和呼吸道攻毒可導致中樞神經系統感染和肺部組織炎癥[11-12]，同時，恒河猴在接受EV71疫苗免疫后，能夠出現與人類相似的免疫反應[13]。有研究將不同種屬的EV71病毒通過靜脈滴注的方式感染4—6年齡的食蟹猴，食蟹猴能針對不同的病毒表現出不同的神經性感染、短暫的淋巴細胞減少和炎癥細胞因子反應等[14]。

非人靈長類實驗動物是比較理想的EV71動物模型，但是由于價格昂貴、飼養不易，該類模型的應用受到限制。

2 嚙齒類動物

嚙齒類動物具有繁殖力強、生長速度快、容易飼養、成本低等優點，而小鼠模型最受關注[15]，小鼠模型主要有以下幾種。

2.1 乳鼠模型

此類模型利用近交系或封閉群乳鼠對EV71易感的特點來構建。早在1979年，有研究發現EV71感染新生ICR乳鼠，可以引起ICR乳鼠四肢癱瘓和肌肉壞死等癥。至今有大量關于乳鼠模型的研究報道。有研究利用新生ICR乳鼠腹腔注射建立了EV71動物模型，乳鼠在攻毒后10 d內發病死亡。同時進行了EV71中和抗體的保護試驗，并證明了其保護能力，該研究建立了一種母傳抗體的評價方法，彌補了乳鼠由于易感期短，在接種疫苗后無法產生抗體的不足[16]。

至今，乳鼠模型的研究已經趨近成熟。乳鼠對EV71易感性與周齡有密切關系，日齡越小，感染后的表現癥狀越明顯。該類模型一般采用5日齡以內的ICR或C57乳鼠[17]，而2周齡及以上的小鼠無論通過何種方式感染，均無法出現感染癥狀[18]。攻毒方式以腹腔、尾靜脈、顱內注射為主。一般攻毒后3～5 d發病，可出現精神萎靡、后肢麻痹、癱瘓、甚至死亡[19-20]。然而該模型具有個體較小、操作不易等缺點。

2.2 病毒馴化小鼠適應株模型

此類模型著眼于對分離的EV71毒株在實驗小鼠身上多次傳代進行訓化，使其對實驗小鼠更易感。有研究將阜陽EV71毒株在1日齡的ICR小鼠連續傳代，對比發現，傳代株感染小鼠后，小鼠的體重增長緩慢且病毒組織分布、肌肉毒性、感染持續性高于出發株[21]。分析認為，EV71在小鼠體內或者細胞中經過多次傳代發生適應性突變，某些突變影響這病毒的嗜性和毒性，引起小鼠的適應性和神經毒性增強。

傳代株雖然有高度的神經感染能力，能夠增強小鼠在感染病毒后的發病癥狀，但是對延長小鼠對病毒易感周齡的作用不大[22]。

2.3 免疫缺陷鼠模型

有研究將EV71病毒在3周齡非肥胖型糖尿病/重癥聯合免疫缺陷轉基因小鼠(NOD/SCID)中顱內多次傳代并感染NOD小鼠模型，該模型對傳代株表現出較明顯的感染癥狀，且易感期延長到6周齡[23]。有研究通過多次傳代獲得了干擾素受體α/β/γ缺失小鼠(AG129)和干擾素受體α/β缺失小鼠(A129)的EV71傳代株。使用該毒株腹腔注射攻毒AG129和A129小鼠，小鼠的易感期達到10周齡，表現出較高的致死率。同時發現多一個干擾素因子敲除的AG129小鼠對馴化毒株更為敏感[24-25]。

免疫缺陷鼠模型雖然延長了小鼠對EV71的易感周期，但是由于其缺乏免疫細胞，無法用于相關疫苗的評價，也無法模擬神經和心肺癥狀[24]，限制了其應用。

2.4 受體基因修飾小鼠模型

近交系小鼠中轉入EV71進入人體細胞的受體基因，以期獲得與人類更加相似的感染癥狀，是EV71小鼠模型研究的新突破。相關受體基因也一直在研究[26]。目前發現的受體主要有：清道夫受體B2(SCARB2)[27-29]，P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)[29]，樹突細胞特異性細胞間粘附分子-3捕獲非整合組(DC-SIGN)[30]、膜聯蛋白A2(Anx2)[31]等。

有研究建立了表達人PSGL-1基因的轉基因小鼠，但是該品系只對小鼠肌肉適應的EV71易感，對臨床分離株的易感性較差[32]。研究發現，PSGL-1只是部分EV71毒株感染人T細胞的受體，在細胞水平有一定的作用，在動物水平的作用則不明顯[33-34]。

SCARB2存在于人上皮細胞，屬于CD36類溶酶體膜蛋白，在人腸道和呼吸道都有大量表達[27-28]。目前已經有大量的研究確認SCARB2是所有EV71毒株感染人的早期受體[35]，在EV71感染過程中，可與SCARB2結合并促使EV71完成感染過程[36]。由此，基于人SCARB2受體的基因修飾小鼠研究比較多，有研究構建了SCARB2基因轉基因小鼠，并發現能夠在3周齡通過顱內或尾靜脈感染EV71的Isehara 毒株[37]。另一SCARB2轉基因小鼠中，小鼠對多株EV71病毒易感，但是肢體癱瘓的發生率卻沒有明顯的提高[38]。有研究為了增強小鼠的易感性能，將SCARB2受體轉入小鼠和STAT-1基因缺失小鼠交配，得到SCARB2(+/+)STAT-1(-/-)雜交小鼠，該小鼠對EV71更加易感[39]。

本實驗室通過基因定點敲入的方式構建了SCARB2基因敲入小鼠[40]，能夠穩定的遺傳插入的人SCARB2基因。該小鼠對EV71多種毒株易感，能夠呈現最長6周齡的易感期。通過顱內和尾靜脈注射攻毒后，小鼠模型能夠呈現四肢麻痹、毛發褶皺、弓背等感染癥狀[41-42]。利用該小鼠模型較長的易感期，在評價EV71疫苗的體內保護力時，可以采用小鼠自身抗體代替以往母傳抗體的方法。

3 小結和展望

對于傳染病的研究，不可或缺的就是一個良好、穩定的動物模型。就目前的研究，乳鼠模型研究較多，積累的經驗也比較豐富，但也有本身不可避免的缺點。受體轉入小鼠動物模型是近幾年伴隨著遺傳修飾技術而發展的新型模型，其操作更為方便，更有研究前景。目前，人類SCARB2受體轉入模型的構建較為成功，隨著人類對EV71感染過程的深入了解，更多影響病毒感染以及傳播的受體、免疫因素被發現，不同種類的受體轉入、免疫缺失等遺傳修飾動物模型將會被構建。

有學者認為，手足口病動物模型的發病情況取決于病毒、宿主和環境等因素的共同作用[43]。目前建立的EV71動物模型在應用上還有很多方面值得進行深入研究。