心肌細胞特異性Snhg5過表達轉基因小鼠的建立和應用*

孔靜祎 徐京平 劉瀾濤 王添樂 侯 寧 李振華 楊 曉 王 劍

(軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所，北京 102206)

近年來，隨著我國社會經濟發展，國民生活方式的變化，尤其是人口老齡化及城鎮化進程的加速，心血管病患病率和死亡率處于持續上升階段。目前，中國心血管病死亡占城鄉居民總死亡原因的首位，農村為46.66%，城市為43.81%，心血管病給居民和社會帶來的經濟負擔日漸加重。心臟重塑是多種心血管疾病(如高血壓、心肌缺血、心律失常等)的共同病理過程，隨著心臟重塑的進展，心力衰歇和心源性猝死發生率顯著提高。因此，闡明心臟重塑的發生機制，尋找調節心臟重塑發生的新型調控分子對于防治心力衰竭以及改進心臟疾病個性化治療策略具有重要和積極的意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNA分子[1]。近年來的研究表明LncRNA在心臟發育和病理重塑過程中發揮著非常重要的作用。如，小鼠心臟相關LncRNA AK143260(braveheart，Bvht)通過控制心臟細胞分化調節基因中胚層后螺旋轉錄因子1(mesoderm posterior 1，MesP1)，Bvht通過激活參與心臟中胚層向各類心臟前體細胞轉化的基因網絡，來刺激干細胞分化為特定的心臟細胞[2-3]。肌球蛋白重鏈相關RNA轉錄本(myosin heavy chain associated RNA transcripts，Mhrt)在心臟組織中特異性表達，功能研究顯示其可以抑制病理性心肌肥厚的發生[4]。另一種在心臟組織中豐度較高的心肌肥厚相關表觀遺傳調節因子(cardiac-hypertrophy-associated epigenetic regulator，Chaer)，能通過與多梳蛋白抑制復合體2(polycomb repressor complex 2，PRC2)復合體內的Zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)相互作用，在心肌肥厚的發生及相關基因表達調控的過程中發揮重要的功能[5]。此外，長鏈非編碼RNA H19能夠抑制心肌細胞的肥大生長，在心臟組織中過表達H19能夠緩解病理性心室重塑[6-7]。Snhg5(small nucleolar RNA host gene 5)，又稱U50HG, 是非蛋白編碼小核RNA (SnoRNA)宿主基因家族和5′-寡嘧啶家族基因的一個成員，近年來的研究顯示其在腫瘤發生發展過程中具有重要的功能。本團隊前期研究發現Snhg5在發生病理性心臟重塑的小鼠模型心臟樣品中表達水平上調，提示其在心臟重塑發生過程中可能發揮了重要功能，但目前關于其在心臟組織的功能還未見報道。

為了研究Snhg5在心臟組織中發揮的功能，本研究建立了心肌細胞特異性Snhg5過表達轉基因小鼠。該小鼠的成功建立將首次提供體內的遺傳學證據揭示Snhg5在心臟穩態維持中發揮的功能，并也有可能為未來探索心臟重塑發生機制，及發展心臟疾病的治療策略提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1質粒與菌株：α-MHC-Cre-hGH載體由本室保存。

1.1.2實驗動物：40只SPF級FVB小鼠，體質量25～28 g，來源于維通利華公司【SCXK(京)2021-0011】。本實驗按照生命組學研究所國家蛋白質科學中心北京實驗動物管理與使用委員會的相關規定進行實驗，倫理委員會審批號：IACUC-20200515-17MB。

1.1.3工具酶和試劑：所用的限制性內切酶、T4 DNA連接酶、mRNA Selective PCR Kit (AMW)Ver 1.1均購自TaKaRa(大連)公司，蛋白酶K購自Merck公司。試劑盒QIA prep Spin Miniprep Kit購自Qiagen公司，瓊脂糖為Biowest Agarose瓊脂糖，核酸染料(EL105)購自北京博邁德基因技術有限公司。蘇木素(HHS16)購自Sigma公司。0.1 mol/L檸檬酸鹽修復液(ZLT9065)、雙氧水(PV-6001)、山羊血清工作液(ZLI-9056)、一抗稀釋液(ZLI-9020)、兔二步法試劑盒(PV6002)購自北京中杉金橋有限公司。TSA Systems相關顯色試劑購自PerkinElmer公司。Trizol購自Invitrogen公司。Real-time PCR Mix(QPK-201)購自TOYOBO公司。

1.2 方法

1.2.1心肌細胞特異性過表達Snhg5 (α-MHC-Snhg5-hGH)轉基因載體的構建：以小鼠心臟組織cDNA為模板擴增獲得小鼠Snhg5，引物為：MHC-Snhg5 1 s(5′-TTTGTCGACGGGCTCGTTCTTTTACG ACG-3′)和Snhg5 1a(5′-TTTAAGCTTTTTGCAA TTGAATGTTTTTTA-3′)，引物兩端分別引入了SalⅠ和HindⅢ酶切位點。PCR擴增體系：1 μL cDNA，25 μL 2 × buffer ，10 μL dNTPs，1 μL KOD酶，1 μL上游引物，1μL下游引物，ddH2O補足50 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃復性30 s；72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。將擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，回收1.1 kb左右的目的片段，克隆入T載體中，測序結果確認序列準確無誤無任何突變。將測序正確的Snhg5 片斷連入用SalⅠ和HindⅢ酶切的α-MHC-Cre-hGH載體，得到了含有α-MHC啟動子、Snhg5基因以及人生長素基因polyA共3個元件的α-MHC-Snhg5-hGH的轉基因載體。

1.2.2受精卵的顯微注射：將α-MHC-Snhg5-hGH的轉基因載體經KpnⅠ和SacⅡ酶切線性化后，通過受精卵原核顯微注射法[8]，共注射FVB小鼠受精卵200枚，然后將獲得的受精卵移入8只母鼠的輸卵管內進行妊娠。實驗用FVB小鼠飼養于SPF級動物房。

1.2.3轉基因小鼠的基因型鑒定：取出生后10 d左右的子代小鼠，剪下約0.5 cm的尾尖置于1.5 mL離心管中，加入400 μL組織裂解液，50 ℃保溫過夜，制備基因組DNA作為PCR的模板。αMHC-Snhg5轉基因特異引物α-MHC-s和MHC-Snhg5-2a由擎科公司合成，其中MHC-1: 5’-ATGACA GACAGATCCCTCCTATCTCC-3’位于α-MHC啟動了序列上，MHC-Snhg5b-2a位于Snhg5片段上，序列為5’-CGCCATTGTCCTTGTGAA-3’。可擴增獲得300 bp的片段，用于陽性轉基因小鼠的檢測。PCR擴增體系：20 μL體系：1μL小鼠DNA，10 μL 2 × mix ，7 μL ddH2O，1μL上游引物，1μL下游引物。PCR擴增的條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.2.4Snhg5在不同組織中表達水平的檢測：提取心臟及其他組織RNA，將提取的RNA按 TOYOBO公司的ReverTra? Ace qPCR RT Master Mix進行逆轉錄反應，反轉體系為：RNA 2 μg；5×RT Mix (TOYOBO) 2 μL；DEPC水補足至10 μL。反應條件為：37 ℃ ，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。

利用7500 Fast real-time PCR system對上述獲得的cDNA進行檢測。引物序列為：

GAPDH sense: 5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′；

GAPDH antisense: 5′-GGTCCTCAGTGTAGCCC AAG-3′；

Snhg5 sense: 5′-CAGTCCGCCTGTGAAGAT-3′；

Snhg5 antisense: 5′-CTGCCAGAATAAGGAAA TAG-3′；

擴增條件為：95 ℃：20 s，95 ℃：60 s，95 ℃：15 s，60 ℃：15 s，72 ℃：45 s，40個循環；95 ℃：15 s； 60 ℃：60 s； 95 ℃：30 s； 60 ℃：15 s。

1.2.5小鼠心臟組織學檢測：取兩個月小鼠心臟組織于4% PFA固定過夜后，放入包埋機中進行系列組織脫水和透蠟，包埋蠟塊。利用石蠟切片機制作厚度為5 μm的組織切片，用于H&E和Masson染色觀察心臟組織形態和纖維化改變情況，以及Laminin免疫熒光染色檢測心肌細胞表面積改變[9]。

1.3 統計學分析

數據以均數 ± 標準誤表示，使用統計學軟件Graphpad進行統計學分析。數據進行非配對t檢驗，P<0.05和P<0.01具有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建心肌細胞特異性Snhg5轉基因載體(αMHC-Snhg5-hGh)

α-MHC-Snhg5轉基因載體主要含有3個元件：5.5 kb啟動子片斷，1個1.1 kb的Snhg5基因和2.1 kb含有內含子的人生長激素(hGH)PolyA序列(圖1A)。對得到的載體進行SalⅠ 和HindⅢ 酶切鑒定，顯示出現10.7 kb 和1.1 kb的片斷，其結果與預期結果相符(圖1B)。進一步利用Snhg5全長引物對載體進行 PCR鑒定，轉基因載體出現1.1 kb條帶，與預期結果相符(圖1C)。

圖1 α-MHC-Snhg5轉基因載體的構建與鑒定注：A. α-MHC-Snhg5轉基因載體結構示意圖；B. 轉基因載體Sal Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切鑒定圖,1和10：DNA 相對分子質量標準,2～9：連入Snhg5片段的α-MHC-Snhg5-hGH質粒；C. 轉基因載體PCR鑒定圖,1和10：DNA 相對分子質量標準；2～8:連入Snhg5片段的α-MHC-Snhg5-hGH質粒Fig.1 Construction and identification of α-MHC-Snhg5 transgenic vectorNote：A. Structure diagram of α-MHC-Snhg5 transgenic vector; B. Restriction map of transgenic vectors digested by Sal I and Hind Ⅲ,1 and 10:1 kb DNA relative molecular weight standard， 2～9: α-MHC-Snhg5-hGh vectors; C. PCR identification map of transgenic vectors，1 and 10:1 kb DNA relative molecular weight standard， 2～8： α-MHC-Snhg5-hGh vectors

2.2 α-MHC-Snhg5轉基因小鼠的構建

利用KpnⅠ和SacⅡ 酶切去除原核載體序列，電泳回收8.7 kb的α-MHC-Snhg5轉基因片段。該片段純化后，用注射用TE稀釋至2.0 ng/μL。通過顯微注射，將該片段導入小鼠受精卵雄原核中。共注射FVB小鼠受精卵200枚，然后將獲得的受精卵移入8只母鼠的輸卵管內進行妊娠，有3只假孕母鼠懷孕，獲得子代小鼠14只，陽性小鼠4只，陽性率28.6%。提取了子代小鼠的鼠尾DNA，利用α-MHC-Snhg5轉基因特異引物α-MHC-s和 MHC-Snhg5-2a進行PCR鑒定，發現轉基因首建者小鼠出現300 bp的陽性條帶(圖2)。

圖2 小鼠基因型鑒定結果圖注：1和10：Mark Ⅰ DNA相對分子質量標志物；2～4：轉基因首建小鼠；5～8：非轉基因小鼠作為陰性對照；9：轉基因載體作為陽性對照Fig.2 Results of mouse genotypingNote：1,10: Mark Ⅰ DNA relative molecular weight standard; 2～4: transgenic founder mice;5～8: non-transgenic mice; 9: Transgenic vector as positive control

2.3 α-MHC-Snhg5轉基因小鼠不同組織中Snhg5表達水平的檢測

為檢測Snhg5過表達的組織特異性，利用實時定量PCR檢測了轉基因小鼠不同組織中Snhg5的表達情況。結果顯示α-MHC-Snhg5轉基因小鼠心臟組織中的Snhg5表達水平較對照小鼠心臟明顯升高(圖3A)，而其他組織內Snhg5無過表達情況 (圖3B)，表明心肌細胞特異性過表達Snhg5的轉基因小鼠建立成功。

圖3 轉基因小鼠心臟及其他組織中Snhg5表達水平的檢測注：A. 對照和轉基因小鼠的心臟組織中Snhg5表達水平的檢測；B. 對照組和轉基因小鼠其他組織中Snhg5的表達水平的檢測 Fig.3 Detection of Snhg5 expression level in the multiple tissues of transgenic miceNote: A. Detection of Snhg5 expression level in heart tissue from control and transgenic mice; B. Detection of Snhg5 expression level in other tissues from control and transgenic mice

2.4 Snhg5轉基因小鼠在異丙腎上腺素(ISO)誘導之后更容易發生心臟重塑

對基礎水平和ISO處理情況下轉基因小鼠和對照小鼠心臟組織的大體形態和組織學變化情況檢測結果顯示，盡管2月齡轉基因小鼠和對照小鼠的心臟大體形態和組織學結構在基礎水平無明顯差異(圖4)，但在ISO處理情況下，轉基因小鼠較對照小鼠更容易發生心臟增大(圖4A)，心臟質量與脛骨長度或體重比值明顯增加(圖4B和4C)，心室壁增厚(圖4 D和4E)，以及心肌細胞面積增加(圖4F和4 G)，這些結果表明，與對照小鼠相比，Snhg5轉基因小鼠在ISO處理后更容易發生心肌肥厚，提示Snhg5會促進心臟重塑的發生。

圖4 Snhg5過表達加重ISO引發的心肌肥厚注：A．心臟大體形態分析；B，C：鼠心臟質量與脛骨長度比值，小鼠心臟質量骨長度比值統計結果，n=5，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0005；D，E：心臟組織切片的H&E和Masson染色結果；F. 心臟組織切片的Laminin免疫熒光染色結果；G. 小鼠心臟切片細胞表面積的統計結果，n=3，*P<0.05Fig.4 Overexpression of Snhg5 aggravates ISO-induced cardiac hypertrophyNote: A. Cardiac gross morphology analysis of different groups of mice; B, C:Ratio of heart weight to tibia length or body weight,n= 5, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0005; D, E: H&E and Masson staining results of heart tissue sections; F.Laminin immunofluorescence staining of heart tissue sections; G:Statistical results of cell surface area of heart sections, n=3, *P<0.05

3 討論

轉基因技術是將外源DNA導入動物受精卵或胚胎干細胞內，以隨機插入或同源重組的方式整合到受體染色體中，并隨細胞的分裂而遺傳給后代的技術[10]，通過該技術為生命科學和醫學科學研究提供了一系列理想的疾病模型。隨著LncRNA在心臟中功能研究的深入，建立心臟組織特異性LncRNA轉基因疾病動物模型對于研究LncRNA在心臟穩態維持中的功能和相關機制非常必要，而目前僅有少量心臟組織特異性LncRNA轉基因小鼠模型被報道[11-12]。在前期研究中發現，Snhg5在主動脈結扎手術(TAC)引起的病理性心肌肥厚和心衰小鼠模型心臟組織中表達水平明顯升高。為了研究Snhg5在心臟穩態維持中的功能，本研究中利用轉基因技術建立了心肌細胞特異性Snhg5轉基因小鼠，利用實時定量PCR對不同組織內Snhg5的表達水平進行檢測，發現Snhg5只在轉基因小鼠心臟中表達水平明顯升高，表明該轉基因小鼠建立成功，為研究Snhg5在心臟組織中的功能提供了理想的動物模型。

目前關于Snhg5功能的研究大多局限在腫瘤發生發展的過程中。Snhg5在多種癌癥中異常表達，影響著腫瘤細胞的增殖、遷移、轉移、侵襲、凋亡、細胞周期和自噬等[13]。Snhg5可以作為miRNA的 sponges調控癌癥的表型和惡性程度[14]。Snhg5還可以通過調控包括Wnt/β-catenin信號通路在內的一些重要的信號通路，以及調節上皮細胞-間充質轉化(EMT)過程[15]，從而影響癌癥的發生及進展。此外，Snhg5還可作為腫瘤的血清學診斷分子標志物[16]。而迄今為止，關于Snhg5在心臟穩態維持中是否發揮功能尚未見報道。通過對建立的心肌細胞特異性Snhg5小鼠進行表型分析，發現盡管轉基因小鼠的心臟組織形態在基礎水平與對照小鼠無明顯差別，但在特定病理刺激下更容易發生心臟重塑，表明Snhg5過表達會促進心臟重塑。

綜上所述，心肌細胞特異性Snhg5過表達轉基因小鼠的成功建立不僅有助于揭示Snhg5在心臟穩態維持中的功能，還可能成為研究人類心臟疾病發生機制、開展新藥研發及療效評價的理想動物模型。