eEF1A2敲除對小鼠骨骼肌組成的影響*

宋子岱 郭 萌 裴 朗 王 妍 李長龍 杜小燕 陳振文

(首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

骨骼肌是人體最大器官，約占人體體重的40%[1]，其功能主要包括收縮、產熱、代謝和內分泌等。骨骼肌含量和結構組成異常，可導致機體運動障礙、累及器官受損，甚至危及生命[2]。骨骼肌纖維分為快肌纖維和慢肌纖維，快肌纖維以肌球蛋白重鏈4(myosin heavy chain 4,Myh4)基因編碼的2B型纖維為主，其纖維直徑更粗、收縮力量大且以糖酵解代謝為主；慢肌纖維以肌球蛋白重鏈7(myosin heavy chain 7,Myh7)基因編碼1型纖維為主，其線粒體數量更多、毛細血管網更豐富、抗疲勞能力更強[3]。研究表明，衰老會引起快肌纖維向慢肌纖維的轉換，致使老年人運動能力和活動范圍下降，容易出現代謝異常并增加糖尿病、高血壓等疾病風險，生活質量嚴重下降[4]，但引起骨骼肌質量下降和纖維類型轉換的分子機制目前仍不完全清楚。

真核細胞翻譯延長因子1-α(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha,eEF1A)作為G蛋白家族成員，是構成真核延長因子1的4個亞基之一[5]。eEF1A在哺乳動物中存在2種亞型，eEF1A1在哺乳動物組織廣泛表達，而eEF1A2僅在心臟、骨骼肌以及腦中表達[6]。eEF1A依賴GTP催化氨基酰tRNA與核糖體A位點的結合，將氨基酰化的tRNA在蛋白翻譯的延伸階段募集到核糖體中，以此調控蛋白翻譯的延伸階段[7]。純合Wasted小鼠(eEF1A2基因啟動子和第一外顯子缺失)，表現出嚴重的神經退變表型，在出生23 d即死亡[8]；臨床研究也顯示，eEF1A2突變會造成兒童腦發育滯后，肌張力低下和心肌病[9]。這些研究表明，eEF1A2在機體發育過程中發揮關鍵作用。前期研究發現，骨骼肌eEF1A2通過激活蛋白激酶Cβ和內質網應激，加劇了雄性糖尿病動物模型的胰島素抵抗[10]，這說明eEF1A2也參與了骨骼肌葡萄糖代謝過程。盡管eEF1A2在腦和心臟發育以及骨骼肌代謝中發揮重要作用，然而eEF1A2是否參與調控骨骼肌的結構和組成目前尚不清楚。

本研究利用12月齡eEF1A2基因全身敲除小鼠，檢測其主要骨骼肌類型的臟器系數、骨骼肌形態以及快慢肌纖維標志物的表達變化，以探討eEF1A2對小鼠骨骼肌組成和纖維類型的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：Cre-ERT2小鼠由北京生命科學研究所王鳳超博士贈送，eef1a2flox/flox(eef1a2fl/fl)小鼠委托北京唯尚立德生物科技有限公司利用CRISPER/Cas9技術制作。實驗所需eef1a2fl/fl;CreERT2+小鼠(iHBKO)及其對照eef1a2fl/fl;CreERT2-小鼠(Control)飼養于首都醫科大學SPF級動物房【SYXK(京)2018-0003】，自主飲食和飲水，溫度(22±4)℃，濕度 55% ± 5%，室內光照明暗周期12 h/12 h。所有實驗操作嚴格遵守動物倫理和動物福利的要求，按照首都醫科大學實驗動物管理委員會的相關規定進行實驗，倫理委員會審批號：AEEI-2017-097。將12月齡的iHBKO小鼠(9只，2雄7雌)和對照Control小鼠(3只，2雄1雌)分別連續3 d腹腔注射30 mg/kg他莫昔芬，觀察1周后進行相關實驗。小鼠實施安死術后，分離雙下肢腓腸肌、脛骨前肌、比目魚肌以及趾長伸肌，分別放入4%多聚甲醛固定以及液氮凍存。

1.1.2主要試劑：他莫昔芬(Sigma)；玉米油(Sigma)；TRIzol(諾唯贊)；5 × All-In-One RT Master Mix試劑盒(abm)；EvaGreen 2 × qPCR MasterMix試劑盒(abm)；BCA 蛋白質濃度測定試劑盒(康為世紀)；蘇木精染液(中杉金橋)；伊紅染液(中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：利用TRIzol有機溶劑抽提法提取小鼠骨骼肌mRNA，使用5 × All-In-One RT Master Mix試劑盒將2 μg mRNA反轉錄為cDNA。qRT-PCR使用Bio-Rad CFX Connect系統和EvaGreen 2 × qPCR MasterMix進行。反應體系設置為cDNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，純水7 μL以及EvaGreen 2 × qPCR MasterMix 10 μL。反應條件設置為95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重復 40 個循環，熔解曲線設置為 60 ℃ 5 s。統計結果使用的公式為：mRNA 相對表達量= 2-△△Ct。以Gapdh作為內參基因，引物序列如表 1 ，均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences for real-time quantitative PCR

1.2.2Western Blot：將小鼠骨骼肌放入RIPA∶PMSF=100∶1溶液中并利用勻漿機打碎，在15 000 r/min，15 min條件下獲得蛋白上清液，利用BCA 蛋白質濃度測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific)對蛋白上清液進行濃度測定并進行定量、變性。取20 μg 蛋白進行 SDS-AGE 凝膠電泳分離，電轉蛋白至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜在5% 脫脂牛奶中封閉1 h。eEF1A2抗體(1∶1 000 稀釋，Proteintech)以及GAPDH抗體(1∶1 000 稀釋，華安生物)4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌后與二抗(HRP)室溫孵育 1 h，TBST 洗膜后用化學發光法顯色。利用凝膠圖像分析系統(Bio-Rad)掃描蛋白質印跡條帶灰度。

1.2.3HE染色：將小鼠骨骼肌于4%多聚甲醛中固定24 h后，進行常規組織脫水、石蠟包埋及病理切片的制備。進行染色時將石蠟組織切片按如下順序進行操作：二甲苯(I) 5 min—二甲苯(Ⅱ) 5 min—二甲苯(Ⅲ) 5 min—100%乙醇(Ⅰ) 2 min—90%乙醇(Ⅱ) 2 min—80%乙醇(Ⅲ)2 min—70%乙醇(Ⅳ) 2 min—流水沖洗5 min—蘇木精液染色5 min—流水稍洗去蘇木精液1～3 s—19鹽酸乙醇1～3 s—流水洗至返藍—0.5%伊紅液染色1～3 min—蒸餾水洗1～2 s—80%乙醇洗1～2 s—95%乙醇(Ⅰ) 2～3 s—100%乙醇(Ⅱ) 3～5 s—二甲苯(Ⅰ) 2 min—二甲苯(Ⅱ) 2 min—二甲苯(Ⅲ) 2 min，最后用中性樹膠封固。

1.2.4統計學分析：利用GraphPad Prism完成統計分析，結果表示為平均值±SEM。符合正態分布的計量資料兩組間的比較采用非配對的t檢驗，P<0.05被認為有統計學意義。

2 結果

2.1 他莫昔芬誘導的eEF1A2全身敲除小鼠骨骼肌eEF1A2敲除效率驗證

qRT-PCR顯示，在快肌腓腸肌(gastrocnemius，GA)(圖1A，P<0.01)和趾長伸肌(extensor digitorum longus，EDL)(圖1B，P<0.000 1)，慢肌比目魚肌(soleus，SOL)(圖1C，P<0.000 1)和脛骨前肌(tibialis anterior，TA)(圖1D，P<0.001)中，eEF1A2表達水平與對照組相比均極顯著降低；同時，氨基酸序列與eEF1A2高度同源的eEF1A1，其mRNA表達水平在實驗組和對照組差異無顯著性(圖1A—D)。Western Blot顯示iHBKO小鼠腓腸肌(GA)(圖2A)、趾長伸肌(EDL)(圖2B)、比目魚肌(SOL)(圖2C)以及脛骨前肌(TA)(圖2D)中eEF1A2蛋白水平均極顯著下降(圖3，P< 0.001)。以上結果說明，他莫昔芬誘導的iHBKO小鼠在骨骼肌組織中實現了eEF1A2的高效敲除。

圖1 iHBKO小鼠骨骼肌eEF1A2及eEF1A1轉錄水平檢測注：利用qRT-PCR對iHBKO小鼠A(腓腸肌，GA)，B(趾長伸肌，EDL)，C(比目魚肌，SOL)以及D(脛骨前肌，TA)的eEF1A2以及eEF1A1轉錄水平進行檢測；**、***和****分別表示P< 0.01、P< 0.001和P< 0.0001的統計學顯著性Fig.1 Detection of eEF1A2 and eEF1A1 transcript levels in skeletal muscle of iHBKO miceNote：The eEF1A2 and eEF1A1 transcript levels of A (gastrocnemius，GA), B(extensor digitorum longus，EDL), C(soleus，SOL) andD( tibialis anterior，TA) muscle in iHBKO mice were detected by qRT-PCR. **，*** and **** denoted statistical significance at P< 0.01，P< 0.001 and P< 0.0001, respectively

圖2 iHBKO小鼠骨骼肌eEF1A2蛋白水平檢測注：利用Western Blot對iHBKO小鼠A(腓腸肌，GA)，B(趾長伸肌，EDL)，C(比目魚肌，SOL)以及D(脛骨前肌，TA)的eEF1A2蛋白水平進行檢測Fig.2 Detection of eEF1A2 protein levels in skeletal muscle of iHBKO miceNote：The eEF1A2 protein levels of A(gastrocnemius，GA), B(extensor digitorum longus，EDL), C(soleus，SOL) and D(tibialis anterior， TA) muscle in iHBKO mice were detected by Western Blot

圖3 iHBKO小鼠骨骼肌eEF1A2 Western Blot統計結果注：對圖2中Western Blot結果進行統計；***和****分別表示P< 0.001和P< 0.0001的統計學顯著性Fig.3 Western blot analysis for eEF1A2 in skeletal muscle of iHBKO miceNote：Statistical analysis of Western blot results in Figure 2； *** and **** denoted statistical significance at P< 0.001 and P<0.0001, respectively

2.2 eEF1A2敲除導致小鼠腓腸肌含量下降

基因敲除小鼠幾種主要骨骼肌的臟器系數結果顯示，iHBKO小鼠腓腸肌臟器系數與對照相比顯著下降(圖4，P<0.05)，而兩種慢肌(脛骨前肌與比目魚肌)臟器系數與對照組相比也有下降的趨勢。對eEF1A2基因敲除小鼠骨骼肌組織形態學分析，HE染色顯示iHBKO小鼠腓腸肌與對照組相比未出現萎縮現象(圖5)；且腓腸肌橫截面積在敲除小鼠(812.0±40.72 μm2)和對照小鼠(902.5±55.83 μm2)中無差異(圖6)。分析認為，eEF1A2敲除小鼠腓腸肌含量減少。

圖4 iHBKO小鼠骨骼肌臟器系數統計注：分別記錄iHBKO小鼠4種骨骼肌重量，并分別除以小鼠體重，得到4種骨骼肌臟器系數；*表示P<0.05的統計顯著性Fig.4 Organ coefficients of skeletal muscle of iHBKO miceNote：Four skeletal muscle weight/body weight in iHBKO mice were recorded；* denoted statistical significance at P<0.05

圖5 iHBKO小鼠腓腸肌HE染色結果注：對iHBKO小鼠腓腸肌切片進行HE染色，觀察腓腸肌形態及橫截面積Fig.5 HE staining of gastrocnemius muscle of iHBKO miceNote：HE staining was performed on gastrocnemius muscle sections from iHBKO mice to detect the gastrocnemius muscle morphology and cross-sectional areas

圖6 iHBKO小鼠腓腸肌橫截面積統計注：利用Image J軟件統計圖5中腓腸肌橫截面積Fig.6 Analysis of iHBKO mice gastrocnemius cross areasNote：Use Image J to analyze the gastrocnemius muscle cross-sectional areas in Figure 5

2.3 eEF1A2敲除導致小鼠快慢肌纖維組成改變

利用qRT-PCR分別檢測4種代表性骨骼肌組織中快肌纖維標志物Myh4和慢肌纖維標志物Myh7的表達變化。結果顯示，eEF1A2基因敲除小鼠中，在快肌腓腸肌(GA)(圖7A，P<0.001)和趾長伸肌(EDL)(圖7B，P< 0.000 1)中Myh7表達明顯升高，而Myh4則明顯降低，但在慢肌比目魚肌(SOL)(圖7C，P<0.01)和脛骨前肌(TA)(圖7D，P<0.001)的Myh4和Myh7表達均顯著降低。以上結果提示，eEF1A2基因敲除引起小鼠快肌中的快肌纖維向慢肌纖維的轉化，并導致慢肌中的兩種肌纖維的減少。

圖7 快慢肌標志物在iHBKO小鼠骨骼肌中的表達變化注：利用qRT-PCR對iHBKO小鼠A(腓腸肌，GA)，B(趾長伸肌，EDL)，C(比目魚肌，SOL)以及D(脛骨前肌，TA)的Myh4以及Myh7轉錄水平進行檢測；**、***和****分別表示P<0.01、P<0.001和P<0.0001的統計學顯著性Fig.7 The expression of fast and slow muscle markers in iHBKO miceNote：qRT-PCR was used to detect Myh4 and Myh7 transcript levels in A(gastrocnemius,GA), B(extensor digitorum longus,EDL),C(soleus,SOL), and D(tibialis anterior,TA) muscles in iHBKO mice; **,*** and **** denoted statistical significance at P<0.01,P<0.001 and P<0.0001, respectively

3 討論

骨骼肌支撐著人體的正常生理活動，同時也是人體最大的產熱、代謝和內分泌器官。維持骨骼肌的正常組成和形態是機體活動的必要因素。骨骼肌易受以基因組不穩定性為特點的衰老的影響，這同時也是引起骨骼肌質量下降的最重要原因[11]。在人體老化過程中，骨骼肌肌球蛋白重鏈2型的合成率下降，導致肌纖維數量的減少[4]。從機制上講，老齡人體對胰島素和氨基酸的敏感性降低，二者對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)的激活作用降低，導致蛋白合成減少，進而降低肌肉質量[12]。而作為蛋白質翻譯延伸因子，有研究表明隨線蟲衰老，eEF1A2蛋白的豐度和活性逐漸降低[13]，但也有研究認為在線蟲衰老時eEF1A的表達并不改變[14]，因此在衰老過程中eEF1A的表達模式和功能尚無明確定論。本研究中，eEF1A2基因敲除導致了腓腸肌臟器系數的明顯下降，這表明eEF1A2在維持腓腸肌含量發揮重要作用，這可能是通過其蛋白翻譯延長效率實現的。由此可見，eEF1A2對骨骼肌質量有一定影響。

骨骼肌中快肌與慢肌的比例不是一成不變的，通過耐力、爆發力等訓練，快肌和慢肌纖維比例可以互換[15]。在脊髓損傷、長時間臥床、微重力環境等疾病狀態下，慢肌纖維會向快肌纖維轉化，而在Ⅰ型糖尿病、癌癥、衰老等情況快肌纖維會向慢肌纖維轉換[15]。這些非生理性的纖維類型改變往往對人體產生嚴重的影響。如在慢性阻塞性肺病中，膈肌的快肌纖維向慢肌纖維轉化，會使患者呼吸負擔加重[16]；在多種惡性腫瘤患者體內，也出現快肌纖維向慢肌纖維的轉換，并影響患者生存期[15]。因此，維持不同肌纖維在一定比例十分重要。本研究發現，eEF1A2的缺失同時造成了快肌以及慢肌中Myh4基因的表達降低，而Myh4編碼2B型肌纖維以糖酵解代謝為主，屬于快肌纖維。由此推測，eEF1A2可能主要參與快肌纖維的合成和維持，敲除eEF1A2后導致了快肌纖維的減少；同時由于主要肌纖維的減少，為維持骨骼肌的功能，使得快肌中的慢肌纖維代償性的增加，即編碼1型纖維的Myh7的表達增加。綜上，eEF1A2的缺失可能與衰老過程中快肌纖維向慢肌纖維的轉變有關。

本研究通過建立eEF1A2基因敲除小鼠模型發現，eEF1A2的缺失對骨骼肌的形態無明顯影響，但降低了小鼠腓腸肌的臟器系數，同時導致小鼠快肌纖維向慢肌纖維轉化。研究結果為進一步探究eEF1A2對小鼠骨骼肌組成和纖維類型的作用和機制研究提供了動物模型，也為衰老過程中骨骼肌的變化研究提供數據參考。