左氧氟沙星聯合小柴胡顆粒對小鼠抗菌止瀉的研究*

張五萍 伍錫棟 寇 光 侯雄軍

(1江西省人民醫院藥學部，南昌 330006)(2.江西省醫療器械檢測中心藥物安全性評價室，南昌 330006)

抗生素的濫用導致細菌耐藥性不斷增加，超級耐藥性細菌也不斷出現，給腹瀉、痢疾性等感染性疾病的防控帶來了很多的困難[1-2]。腹瀉是多因素引起腸道在感染或非感染因素刺激下，腸黏膜出現發炎、腸分泌及運動功能亢進，出現稀便和便頻等癥狀的疾病[3]。近年來腹瀉發病率不斷上升，嚴重影響人們的身體健康，左氧氟沙星組可用于病原微生物感染的肺炎、泌尿系統疾病的抗菌治療，但對細菌感染易產生耐藥性，小柴胡顆粒的主要成分為半夏、柴胡、甘草、人參、黃芩、生姜、大棗等，具有疏肝健脾和解少陽、和胃降逆、扶正祛邪的功效。現代藥理學研究表明，柴胡具有降血脂、保肝、改善腸道菌群紊亂等作用[4-5]。中醫理論認為，肝臟具有主藏血、主疏泄解毒功能，小柴胡顆粒具有保肝功能，間接提示可以促進肝臟血液循環，增強機體對外來邪氣的耐受性和抵抗能力。

本研究旨在研究分析聯合本身具有抗菌作用的左氧氟沙星與小柴胡顆粒對大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的抗菌和止瀉作用，從而減少大腸桿菌(E.coli)感染致腹瀉的小鼠對左氧氟沙星的依賴性使用，降低抗生素的耐藥性產生，為細菌性腹瀉臨床聯合用藥提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：小柴胡顆粒(廣西嘉進藥業股份有限公司，批號20190709)，鹽酸左氧氟沙星片(安徽萬泰制藥有限公司，批號20190516)，營養肉湯培養基(北京陸橋技術股份有限公司，批號200124)，營養瓊脂培養基(北京陸橋技術股份有限公司，批號200109)；大腸桿菌(E.coli)ATCC(批號160816)購自于北京三藥科技開發公司，由中國食品藥品檢定研究院監制，目前保種于江西省醫療器械檢測中心。

1.1.2主要儀器:恒溫培養箱(HWS-150，天津泰斯特儀器有限公司)，生物安全柜(HR40，海爾儀器設備有限公司)，漩渦混合器(Vortex-KB3，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.3實驗動物：KM小鼠(SPF級)，6—8周齡，體質量(20±2)g，雌雄各半，購自于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】，飼養于IVC實驗動物飼養籠具中【SCXK(贛)2018-0006】。自由飲食水。本試驗通過江西省藥物研究所實驗動物倫理委員會審批，審批號為P202105，符合動物試驗倫理要求。

1.2 方法

1.2.1菌液制備：將E.coli的菌株劃線平板，于37 ℃培養24 h，挑選典型的菌落培養于普通肉湯營養瓊脂上，經37 ℃培養24 h。連續傳代3次，取其菌落用普通肉湯制作菌懸液，用含1.5%蛋白胨的磷酸鹽緩沖液稀釋作為試驗用菌。

1.2.2最小致死量的測定：(1)感染菌的制備：按無菌法操作，從上述制備好的菌液中采用麥氏計數法制成分別為1012、1011、1010、109、108、107、106cfu/mL的不同濃度菌液。(2)動物致死試驗：取體質量為(20±2)g KM小鼠70只，雌雄各半，隨機分為7組，每組10只，分別腹腔注射不同濃度的大腸桿菌細菌溶液，0.5 mL/只，觀察小鼠在7 d內的死亡情況，確定最小致死量(MLD)，即感染后引起小鼠100%死亡的菌液濃度。

1.2.3體內抗菌試驗：另取體質量為(20±2)g KM小鼠50只，雄雌各半，隨機分為5組，分別為模型組(給予生理鹽水)、空白組(給予生理鹽水)、左氧氟沙星組(8 mg/kg，小鼠給藥濃度計算參照《藥理學實驗方法》人體表面計算法)、小柴胡顆粒組(114 mg/kg)、聯合用藥組(左氧氟沙星組8 mg/kg+小柴胡顆粒組114 mg/kg)，每組10只。飼養于室溫(25±2)℃，相對濕度：65%±5%的IVC籠具中，適應性飼養7 d。禁食24 h，不禁水，除空白組外，其余各組小鼠分別腹腔注射大腸桿菌MLD濃度菌各0.5 mL/只，分別于1、6、12 h灌胃給藥1次，以后間隔24 h灌胃給藥1次，空白組與模型組灌胃給予0.9%生理鹽水，給藥組按照劑量濃度給予相應藥物，灌胃體積均為0.2 mL/10 g。連續灌胃15 d，觀察、記錄動物的存活情況，并計算保護率，即存活率=每組存活動物數/每組動物總數×100%。

1.2.4對大腸桿菌致腹瀉小鼠的影響[6]：昆明種小鼠 50 只，隨機分為5 組，即模型組(給予生理鹽水)、空白組(給予生理鹽水)、左氧氟沙星組(8 mg/kg)、小柴胡顆粒組(114 mg/kg)、聯合用藥組(左氧氟沙星組8 mg/kg+小柴胡顆粒組114 mg/kg)，每組10只，自由飲水。各組灌胃體積均為0.2 mL/10 g，給藥劑量見“1.4.3”項，空白組和模型組均給予0.9%生理鹽水，每日1次，連續給藥7 d，7 d后在小鼠腹腔內注射大腸桿菌菌懸液(0.5 mL/只)，造成大腸桿菌感染致腹瀉小鼠模型，空白組腹腔注射等量的生理鹽水；3 h后空白組和模型組小鼠均灌胃生理鹽水，其余組分別灌胃給予相應藥物，灌胃體積均為(0.2 mL/10 g)，觀察腹腔注射大腸桿菌注射液3 h內小鼠腹瀉情況以及給藥3 h內模型組和給藥組小鼠的腹瀉情況(包括稀便次數、總便次數、稀便級(表1)，觀察過程中及時更換濾紙，觀察完后處死動物，解剖小鼠肝臟、腎臟、脾臟，根據結果并計算出腹瀉指數和臟器系數[7]。腹瀉率=腹瀉的動物數/該組動物數×100%，稀便率=每只動物的稀便次數/大便的總次數(稀便以濾紙上有無污跡為標準)，腹瀉指數=稀便率×稀便級，臟器系數=臟器質量(g)/小鼠體質量(g)×100%。

表1 污染直徑與稀便級數對照Table 1 The comparison of pollution diameter with the grade of defecation

1.2.5對大腸桿菌感染致腹瀉小鼠小腸推進的影響[8-9]：KM小鼠50只，禁食24 h，不禁水，隨機分為5組，模型組、空白組、左氧氟沙星組、小柴胡顆粒組、聯合用藥組，每組10只，自由飲水。各組灌胃體積均為0.2 mL/10 g，給藥劑量見“1.4.3”項，空白組和模型組均給予0.9%生理鹽水，每日1次，連續給藥7 d，末次給藥前需禁食不禁水12 h，各實驗組于末次給藥后30 min，空白組灌胃0.1 mL/10 g的炭末，其余組均腹腔注射大腸桿菌菌懸液(菌懸液0.5 mL/只，且同時灌胃炭末0.1 mL/10 g)，30 min后脫頸椎處死，取出小鼠的胃及小腸分離并鋪直至消化道，測量小腸總長度及炭末在小腸的推進距離，計算小腸推進率。(小腸推進率=炭末前沿至幽門距離/小腸全長×100%)。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 大腸桿菌最小致死量測定

通過實驗結果得出大腸桿菌的最小致死量，即感染大腸桿菌后引起小鼠100%死亡的菌液濃度為1×1010cfu/mL(3號菌)，結果見表2。

表2 大腸桿菌對小鼠的最小致死量(MLD)Table 2 The median lethal dose(MLD)of E.coli to mice

2.2 聯合用藥對感染模型動物的影響

與模型組比較，左氧氟沙星組、小柴胡顆粒組和聯合用藥組均有統計學意義(P<0.05)；與小柴胡顆粒組比較，聯合用藥組具有顯著統計學意義(P<0.01)；與左氧氟沙星組比較，聯合用藥組具有統計學意義(P<0.05)。結果見表3。

表3 聯合用藥對大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的保護作用Table 3 The protective function of drugcombination in E.coli mice

2.3 聯合用藥對大腸桿菌致腹瀉小鼠的影響

小鼠注射大腸桿菌菌懸液3 h內出現腹瀉癥狀，便次增多，便質稀軟，精神萎靡，稀水樣便；3 h后給予相應藥物治療，與模型組和小柴胡顆粒組比較，聯合用藥組腹瀉指數均具有顯著統計學意義(P<0.01)，與左氧氟沙星組比較，聯合用藥組腹瀉指數均具有統計學意義(P<0.05)；與空白對照組比較，模型組具有顯著統計學意義(P<0.01)；聯合用藥可以減輕大腸桿菌致腹瀉對小鼠臟器毒性的影響，可提高免疫臟器系數，與模型組、空白對照組、左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，聯合用藥胸腺臟器系數和脾臟臟器系數均有統計學意義(P<0.05)，與空白對照組比較，聯合用藥組肝臟和腎臟臟器系數均無統計學意義(P>0.05)。結果見表4、表5。

表4 聯合用藥對大腸桿菌所致小鼠腹瀉指數的比較Table 4 The comparison of diarrhea index of mice induced by Escherichia coli by combination of drugs

表5 聯合用藥對小鼠臟器系數的影響Table 5 The effect of combination medication on organ coefficient of mice

2.4 聯合用藥對大腸桿菌致腹瀉小鼠的小腸推進率的影響

聯合用藥對大腸桿菌感染小鼠小腸的推進率影響結果見表6。由表6可知，與模型組比較，聯合用藥組小腸推進率具有顯著統計學意義(P<0.01)，與左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，聯合用藥組均具有統計學意義(P<0.05)，與空白組比較具有顯著統計學意義(P<0.01)；與空白組比較，模型組具有極其顯著的統計學意義(P<0.001)，表明聯合用藥可以抑制大腸桿菌感染小鼠的小腸推進速度。

表6 聯合用藥對大腸桿菌感染小鼠小腸推進率的影響Table 6 The influence of combination medication on intestinal propulsion rate of mice infectedwith Escherichia coli

3 結論

感染性腹瀉為臨床常見腹瀉，例如細菌、真菌等感染，細菌性感染腹瀉易造成腸道粘膜受損，腸道菌群失調等功能炎癥，嚴重的甚至會造成機體臟器代謝等功能的減弱。臨床治療腹瀉一般以針對引起感染的病原體抗感染治療為主，如采用左氧氟沙星進行抗菌治療，但單純的抗生素治療容易導致細菌的耐藥性，影響療效。在中醫學上腹瀉類似于泄瀉，是指以排便次數增多，糞質清、稀為特征的疾病[10]，脾虛濕盛、脾胃陽虛是其中的一種病因。中醫學認為，泄瀉病變主要在脾胃，尤其與脾的運化功能失調關系密切，治療上總以運脾化濕為基本原則[11]。小柴胡顆粒是由柴胡、半夏、人參、甘草、黃芩、生姜、大棗等成分組成，現代藥理學研究柴胡入肝膽經，疏達經氣，具有抗腫瘤、抗炎、解熱、保肝和免疫調節等作用；法夏具有和胃降逆的功效；黃芩具有清泄邪熱、抗炎、抗菌等功效；炙甘草、人參可扶助正氣，抵抗病邪；大棗、生姜和胃氣[12-13]，方中諸藥合作，達到抗菌、抗炎和提高免疫力等作用。

本研究通過挖掘小柴胡顆粒能保肝、抗炎和提高機體免疫能力的功效[14]，研究聯合抗菌藥物左氧氟沙星對大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的抗菌和止瀉作用，探索聯合用藥是否可以提高大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的療效，間接減少抗生素的使用，降低細菌的耐藥性產生。唐小云等[15]研究發現小柴胡顆粒可以調節免疫抑制小鼠的外周血淋巴細胞，可刺激CD28、CD80和CD86的表達而調節機體免疫功能。王軍等[16]研究發現小柴胡顆粒可以提高血清IL-2、IL-6和TNF-α水平，提高機體免疫力。上述文獻均表明小柴胡顆粒可以通過調節機體免疫功能，增強機體對細菌感染的耐受性，提高生存率。本研究在體內抗菌實驗中，左氧氟沙星聯合小柴胡顆粒可以降低大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的死亡率，與左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，均有明顯的提高(P<0.05)，提示小柴胡顆粒對大腸桿菌致腹瀉小鼠具有很好的保護作用，其作用可能與小柴胡顆粒提高免疫力等綜合作用有關，改善了大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的腹瀉癥狀，產生了抗菌作用，提高了小鼠機體免疫力，從而加強了對細菌嚴重病變的抵抗性。也有文獻報道小柴胡顆粒可以減輕肝纖維化小鼠血清中的ALT、AST水平，減輕肝臟病理學損傷程度[17]，王麗敏等[18]研究發現小柴胡顆粒能抑制CFA大鼠血清細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及MCS-F的表達，改善CFA大鼠的一般癥狀和炎癥程度，吳山永等[19]研究發現小柴胡顆粒可以提高機體內腸道乳桿菌、雙岐桿菌等菌群水平，調節胃腸道功能，保護菌群和腸道粘膜受損。在對腹瀉指數和炭末推進實驗中，聯合用藥可以降低大腸桿菌感染致腹瀉小鼠的腹瀉指數和炭末推進率，提高小鼠胸腺臟器系數和脾臟臟器系數，與模型組、空白組、左氧氟沙星組和小柴胡顆粒組比較，聯合用藥胸腺臟器系數和脾臟臟器系數均有統計學意義(P<0.05)，同時結果提示聯合用藥可減輕肝臟和腎臟的代謝負擔(與模型組比較，聯合用藥肝臟和腎臟臟器系數均有提高，與空白組比較均無統計學意義(P>0.05))，從而更好地發揮其生理供能，改善小鼠腹瀉癥狀等，給予藥物治療后，小鼠腹瀉癥狀均得到明顯改善，表現為大便次數減少，便質由稀轉干，精神狀態漸好，飲食水狀態改善，且與模型組和小柴胡顆粒組比較，聯合用藥腹瀉指數均具有顯著統計學意義(P<0.01)，與左氧氟沙星組比較，聯合用藥腹瀉指數具有統計學意義(P<0.05)，與空白組比較，模型組均具有顯著統計學意義(P<0.01)。結果間接提示聯合用藥對細菌致腹瀉小鼠的胃腸粘膜損傷等具有保護作用，或運脾水濕等作用，同時結果進一步提示其產生抗菌及胃腸保護作用可能與改善修復胃腸道粘膜、調節腸道菌群水平、改善肝臟等臟器功能及提高機體免疫系統有關，從而減輕或者治療細菌感染致腹瀉的癥狀，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，聯合用藥可以多方面達到藥物的聯合作用效果，中西藥協同作用[20]，充分挖掘中藥的聯合作用，減少抗生素的使用，從而降低細菌的耐藥性產生，本研究結果將為細菌性腹瀉臨床聯合用藥提供數據參考和實驗依據。