肝細胞癌中HP1BP3的表達及其對細胞惡性生物學行為的影響

黃家利，徐 暢，吳 虹，葛 頌，王飛通，牛 堅

肝細胞癌病死率較高[1]，預后較差，5年生存率低于5%[2]。早期診斷對提高肝細胞癌患者的總生存率具有重要意義，晚期患者也亟需新的治療方案。異染色質蛋白1結合蛋白3(heterochromatin protein 1 binding protein 3, HP1BP3)是一種與組蛋白H1有關的蛋白。HP1BP3的染色質結合動力學與H1相似，參與異染色質的合成[3-5]。有研究表明，HP1BP3參與維持異染色質的完整性及細胞周期調控[6]。此外，HP1BP3特異性結合內源性pri-miRNAs，促進人類細胞miRNA的產生[7]。HP1BP3促進腫瘤的發生、發展[8-10]。目前HP1BP3與肝細胞癌的相關性研究較少。本實驗利用TCGA數據庫分析HP1BP3基因與肝細胞癌的關系，體外細胞實驗加以驗證，通過GSEA富集分析可能的相關信號通路及機制。

1 材料與方法

1.1 數據采集從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取376例人肝細胞癌組織和50例正常肝組織的HP1BP3表達數據及相關臨床資料，將HP1BP3表達數據與患者臨床資料相結合，以HP1BP3表達的中位數為界值，將所有肝細胞癌患者分為高表達組和低表達組進行生存分析。

1.2 細胞培養正常肝組織細胞系LO2、肝癌細胞系HepG2及Huh7購自上海中國科學院類型培養庫。所有細胞通過STR圖譜進行鑒定。細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養。

1.3 基因沉默HP1BP3 siRNA oligos購自吉瑪基因公司(http: //www.genepharma.com)。使用siRNA oligos作為陰性對照。采用riboFECT CP Reagent轉染試劑進行瞬時轉染。37 ℃孵育，轉染24～48 h后進行后續實驗，CCK-8、集落形成、侵襲、遷移等功能實驗，48 h后提取細胞蛋白，Western blot法檢測轉染效率。

1.4 CCK-8實驗分別將Huh7、HepG2按照1.5×104個/孔接種于96孔板，在5%CO2、37 ℃恒溫箱中培養。在每日指定時間點加入CCK-8試劑10 μL，連續4天，在5%CO2、37 ℃恒溫箱中孵育2 h后，用Synergy Mx多模式微板儀測定450 nm處的吸光度[12]。

1.5 集落形成試驗細胞接種于6 cm培養皿中(2×104個/皿)，37 ℃培養2～3周，用PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定1 h，室溫下0.1%結晶紫染色30 min，鏡下觀察。陽性集落形成定義為集落>50個細胞。

1.6 Transwell侵襲、遷移試驗將細胞分為兩組，侵襲組預涂10 μL Matrigel模擬細胞基底層，遷移組不預涂。將每200 μL含2×104個細胞的無血清DMEM細胞懸液加入上室，下室中加入10%胎牛血清的DMEM。37 ℃孵育48 h后，用PBS沖洗3次，用棉簽輕輕擦去上室中的非侵襲性細胞。侵襲細胞加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫室溫下染色20 min。倒置顯微鏡下觀察，軟件計數，隨機拍攝。

1.7 免疫組化12例組織切片購自徐州醫科大學附屬醫院(倫理號：XYFY2019-KL129-01)，依次經100%二甲苯、梯度乙醇(100%、95%、85%、75%、50%)脫蠟后抗原修復，內源性過氧化物酶封閉。用PBS洗滌3次后，加入一抗HP1BP3(1 mg/mL，稀釋500倍)4 ℃孵育過夜，再加入二抗孵育20 min。DAB顯色，蘇木精復染。切片經50%、75%、85%、95%、100%乙醇和100%二甲苯脫水5 min，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.8 Western blot法用RIPA裂解緩沖液提取各細胞系中蛋白質，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白質濃度。用7.5%～10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白(50 μg)，轉移到PVDF膜上，室溫下用3%牛血清白蛋白封閉緩沖液封閉2 h，加入一抗HP1BP3(1 mg/mL，稀釋1 000倍)，4 ℃孵育過夜。用1×TBST洗膜10 min，合計3次。室溫下將HRP標記的親和純羊抗兔IgG(H+L)二抗與膜孵育1～2 h，用TBST洗滌后，用BeyoECL Plus進行檢測，化學發光顯影。用Image J軟件對條帶密度進行量化。

1.9 統計學分析應用R包(v3.6.1)對TCGA數據庫數據進行統計學分析。采用Wilcoxon signed-rank檢驗分析HP1BP3在TCGA隊列肝細胞癌和正常肝組織中的表達差異。采用Kaplan-Meier生存分析HP1BP3表達與肝細胞癌患者總生存率關系。采用單變量Cox分析來選擇可能的預后變量。單因素分析確定的變量P<0.05作為多因素Cox分析的候選變量。采用Cox比例風險模型，通過多因素分析確定獨立的預后因素。采用GraphPad Prism 5.01軟件中配對t檢驗對CCK-8實驗數據進行兩組間對比分析。P<0.05為差異有統計學意義。

1.10 基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)使用TCGA隊列的GSEA分析確定HP1BP3表達對肝細胞癌預后影響的潛在機制。以分子簽名數據庫(MSigDB)中的C2(c2.cp.kegg.v7.0.symbs.gmt)作為參考基因集。應用GSEA評估HP1BP3高表達組和HP1BP3低表達組之間的生存差異。每次分析中的基因集排列進行1 000次，若P<0.05則認為基因集顯著富集。

2 結果

2.1 TCGA數據庫肝細胞癌中HP1BP3的表達及其與患者預后的關系TCGA數據庫分析示：肝細胞癌組織中HP1BP3表達較癌旁正常組織顯著上調(P<0.001，圖1A)。HP1BP3高表達患者總生存期較低表達組低(P=0.029，圖1B)，提示HP1BP3表達與患者預后相關。Cox單因素分析示：Stage分期、T分期、M分期和HP1BP3表達是影響肝細胞癌患者預后的因素(P<0.05)。Cox多因素分析示：HP1BP3表達是肝細胞癌患者總生存期的獨立預后因素(表1)。

圖1 A.TCGA數據庫分析HP1BP3在肝細胞癌組織和癌旁正常組織中的表達；B. HP1BP3表達與肝細胞癌患者預后的關系

表1 單因素和多因素Cox回歸分析

2.2 HP1BP3在體外肝癌細胞系及肝癌組織中的表達差異應用Western blot和免疫組化法分別檢測細胞及組織中HP1BP3蛋白的表達，結果顯示，肝癌細胞系中HP1BP3蛋白表達高于正常肝細胞系(P<0.001，圖2A)；免疫組化結果顯示：HP1BP3陽性9例，陰性3例，陽性組癌組織較癌旁組織棕黃色染色深，兩者免疫組化評分有差異(圖2B)。

圖2 A.Western blot法檢測HP1BP3在肝細胞株中的表達：**P<0.001；B.免疫組化檢測HP1BP3蛋白在肝細胞癌組織中高表達，較癌旁正常組織表達高，表達定位于細胞核，PV兩步法

2.3 沉默HP1BP3對人肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響分別轉染HP1BP3 siRNA至Huh7、HepG2細胞中以沉默HP1BP3表達，應用Western blot法檢測轉染效率，轉染HP1BP3 siRNA的肝癌細胞中HP1BP3表達降低，證明轉染成功(P<0.05，圖3)。細胞功能實驗結果：CCK-8(圖4A)和集落形成實驗(圖4B)表明，沉默HP1BP3后的細胞增殖率和細胞存活率均低于對照組(P<0.05)；Transwell圖像及定量分析表明，與對照組相比，沉默HP1BP3后Huh7、HepG2細胞的遷移、侵襲能力受到抑制(圖5)。上述實驗表明，沉默HP1BP3可顯著抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

圖3 Western blot法驗證Huh7(A)、HepG2(B)中HP1BP3 siRNA的轉染效率

圖4 A.CCK-8實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細胞較對照組細胞增殖能力降低，**P<0.001；B.集落形成實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細胞較對照組細胞增殖能力降低，同CCK-8實驗結果相一致

圖5 A.遷移實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細胞組較對照組細胞穿過小室聚碳酸酯膜數量少，細胞遷移能力降低；B.侵襲實驗：沉默HP1BP3后實驗組Huh7、HepG2細胞較對照組細胞穿過基底膠數量少，細胞侵襲能力降低

2.4 GSEA篩選肝細胞癌中HP1BP3相關信號通路通過GSEA對HP1BP3高表達進行富集分析，識別肝細胞癌中激活的信號通路，結果顯示在泛素化、核酸切除修復、RNA降解、ERBB信號通路、細胞周期、細胞凋亡通路中，HP1BP3高表達富集(表2)。

表2 表型高度富集的基因集

3 討論

P1BP3是細胞生長發育不可或缺的組成部分。分。Garfinkel等[4]指出，HP1BP3是H1組蛋白多基因家族成員，廣泛存在于組織和細胞胞核中，以異染色質蛋白1(heterochromatin protein 1, HP1)依賴性方式參與異染色質的合成，HP1BP3缺失影響蛋白的表達。另有研究證實，HP1BP3可以維持異染色質完整性，通過促進G1-S轉變參與細胞周期的調控[6]，HP1BP3在G1-S進展期間通過將常染色質和異染色質相互轉化來激活或沉默特定基因，從而調節G1期的染色質結構以維持細胞周期進程。除此之外，Liu等[7]通過細胞機制研究發現，HP1BP3可以特異性結合內源性pri-miRNAs，促進體內DROSHA/pri-miRNA的結合，從而促進人類細胞miRNA產生，HP1BP3缺失則導致pri-miRNAs從染色質中過早釋放，破壞pri-miRNA的加工。以上研究揭示了HP1BP3的基礎功能，但其與臨床的聯系及意義少有報道，本文采用TCGA數據庫收集臨床數據，通過檢驗分析發現HP1BP3與肝細胞癌相關，且在肝細胞癌組織中高表達；生存分析顯示，HP1BP3低表達組較HP1BP3高表達組生存期長，單因素及多因素分析發現HP1BP3是肝細胞癌的獨立預后因素。以上表明HP1BP3與肝細胞癌發生、發展密切相關。

有研究證實，HP1BP3是腫瘤發生發展的促進因素，有促進癌細胞活力、自我更新和治療抗性作用[8-9]。已有研究發現，HP1BP3在食管癌中可通過上調miR-23a靶向TRAF5促進腫瘤生長和轉移[10]。然而，目前尚未見其在肝細胞癌中的研究報道。本實驗通過體外細胞實驗及免疫組化檢測發現，HP1BP3在癌細胞中表達較正常細胞增多，同時在癌組織中表達量較癌旁組織明顯增高，驗證了數據庫的分析結果。進一步通過調低細胞中HP1BP3基因表達作為實驗組，在功能實驗中發現，實驗組細胞相較于對照組在細胞增殖、遷移和侵襲方面均明顯減弱，這表明HP1BP3可以促進肝癌細胞的惡性行為，或許可以作為篩查肝細胞癌、預測肝細胞癌患者預后及治療靶點的潛在指標。

本組通過查閱文獻發現，HP1BP3可以通過調節內分泌IGF-1成分的轉錄對機體生長和骨骼發育起關鍵作用[11]。同時有研究證實，HP1BP3參與維持異染色質完整性，通過促進G1-S轉變參與細胞周期調控[6]，HP1BP3在G1-S進展期間通過將常染色質和異染色質相互轉化來激活或沉默特定基因來調節G1期的染色質結構以維持細胞周期進程。有研究發現HP1BP3與認知及細胞衰老相關[12-14]。本組通過GSEA[15]篩選出與HP1BP3高表達可能相關的泛素化、核酸切除修復、RNA降解、ERBB信號通路、細胞周期、細胞凋亡通路。上述結果可與已有報道相印證，作為后續HP1BP3機制研究的依據，可以以細胞周期及細胞凋亡[16]為切入點探究其影響肝細胞癌發生發展的機制，為HP1BP3基因的深入研究提供參考。

綜上，HP1BP3可以促進肝細胞癌的發生發展，是影響肝細胞癌預后的獨立危險因素。此外，HP1BP3在肝細胞癌中可能參與了泛素化、核酸切除修復、RNA降解、ERBB信號通路、細胞周期、細胞凋亡通路，可作為下一步研究方向的參考。本實驗仍存在不足之處，數據分析未從多個數據庫聯合驗證，體外實驗未進行恢復驗證，未來可以從多數據庫聯合分析，調低目的基因后再進行恢復驗證。