miR-15b靶向LPAR3對食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

馬麗英，馬新福，馬春蘭

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，已經成為全球第七大常見癌癥，中國的發病率位于全球的第五位[1]。目前食管癌的治療包括手術切除和放療，可顯著改善食管癌患者的預后。然而，由于診斷延遲和轉移頻繁等因素，其5年生存率(41.7%)仍然不能令人滿意[2]。因此，探索食管癌的新治療靶點對于早期診斷和改善臨床結局至關重要。miR-15b已被證明是肝癌[3]、子宮頸癌[4]和子宮內膜癌[5]的重要調節劑。Shao等[6]發現miR-15b與食管鱗狀細胞癌有關，是其新型生物學標志物[7]。有文獻報道食管癌患者外周血中miR-15b呈低表達，過表達miR-15b可抑制食管癌細胞的活力、遷移和侵襲，并促進食管癌細胞凋亡[8-9]，miR-15b可能是食管癌中潛在的生物學標志物。LPAR3與多種癌癥相關[10]，已被證明是miR-15b的靶基因。毛莉等[5]發現miR-15b可通過靶向LPAR3抑制子宮內膜癌細胞增殖。目前miR-15b是否通過靶向LPAR3參與食管癌生物學行為的調控尚不清楚。本文旨在探討miR-15b靶向LPAR3對食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，為食管癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料人食管上皮細胞HEEpiC、人食管癌細胞Eca109購自上海澤葉公司；TRIzol RNA分離試劑及SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Thermo公司；miR-15b mimic、miR-15b陰性對照(miR-NC)、pcDNA-LPAR3和pcDNA3.1載體以及PCR引物序列由上海GenePharma公司設計合成；Transwell小室(美國Corning公司)；RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天公司；兔抗LPAR3(ab137497)、Cyclin D1(ab16663)、MMP-2(ab92536)、MMP-9(ab76003)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)，均購自英國Abcam公司。

ABI Prism 7300型熒光定量PCR系統(美國應用生物公司)；倒置熒光顯微鏡(IX73，日本Olympus公司)；iMark680多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及轉染 取HEEpiC和Eca109細胞接種于RPMI 1640培養基中，在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，隔天換液，每2～3天傳代一次，在細胞達到指數增長期時開始實驗。取對數期生長的Eca109細胞，按2×106個/孔接種于24孔板，分成5個處理組。(1)對照組：未進行任何轉染的Eca109細胞；(2)miR-15b mimic組：將100 nmol/L miR-15b mimic轉染至Eca109細胞；(3)miR-NC組：將100 nmol/L miR-15b mimic陰性對照(miR-NC)轉染至Eca109細胞；(4)miR-15b mimic+pcDNA3.1組：將miR-15b mimic和pcDNA3.1空載體共轉染至Eca109細胞；(5)miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組：將miR-15b mimic和pcDNA-LPAR3共轉染至Eca109細胞。轉染采用Lipofectamine 2000試劑；轉染48 h后收獲細胞以進行以下實驗。另設對數期生長的HEEpiC細胞為空白組。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中miR-15b和LPAR3 mRNA的表達 使用TRIzol試劑提取總RNA，使用分光光度計測量總RNA的濃度。按照試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR擴增。總反應體系20 μL：cDNA(200 ng/μL) 2 μL，SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。循環條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，40個循環。用U6或β-actin作為對照，相對miR-15b和LPAR3 mRNA的表達量采用2-ΔΔCt方法計算。引物序列見表1。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖活力 轉染48 h后，將Eca109細胞以2×103個/孔的濃度接種到96孔板中，繼續培養48 h，每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，于培養箱中孵育4 h，吸去上層清液后加入150 μL DMSO，于490 nm波長處測定各孔的吸光度(OD)，并設置空白孔(只加培養基)，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取轉染48 h后的各組Eca109細胞接種于6孔板中，繼續培養待細胞完全貼壁后，用移液器尖端在每個孔內劃一道痕，置于培養箱中繼續培養，在倒置顯微鏡下觀察，分別在同一位置的0 h和48 h拍照，觀察劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(1-48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%

1.2.5Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將轉染48 h后的各組Eca109細胞重懸于無血清培養基中，并將200 μL(約3×104個細胞)細胞懸液置于上室中。將含有10%胎牛血清(600 μL)的RPMI 1640培養基添加到下室中，37 ℃、5%CO2孵育24 h，取出Transwell小室，室溫下用10%中性福爾馬林固定20 min，37 ℃用0.1%結晶紫染色15 min，ddH2O清洗小室下表面，用濕棉簽小心擦除上室底部膜表面的細胞。晾干后在顯微鏡下隨機取5個視野，拍照；取細胞穿膜數，計算平均值表示細胞侵襲能力。

1.2.6Western blot檢測Eca109細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白的表達 使用RIPA裂解液提取細胞中蛋白質，使用BCA試劑盒對蛋白質濃度進行定量。取等量蛋白質樣品上樣(30 μg/泳道)，10% SDS-PAGE分離蛋白質，并通過半干轉移將其轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉，并在4 ℃下與一抗(LPAR3、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、β-actin，1∶1 000)孵育過夜。第二天，將膜與偶聯辣根過氧化物酶的二抗孵育(1∶2 000)2 h，然后使用化學發光試劑盒(ECL)進行顯色。以β-actin為內參，分析結果。

2 結果

2.1 Eca109細胞中miR-15b和LPAR3 mRNA水平與空白組相比，對照組和miR-NC組Eca109細胞中miR-15b水平明顯降低，LPAR3 mRNA水平顯著升高(P均<0.05)；與對照組相比，miR-15b mimic組細胞miR-15b水平顯著升高，LPAR3 mRNA水平顯著降低(P均<0.05)；與miR-15b mimic組相比，miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組細胞LPAR3 mRNA水平明顯升高(P<0.05，表2)。

表2 各組食管癌細胞中miR-15b和LPAR3 mRNA水平

2.2 Eca109細胞的增殖活力對照組和miR-NC組Eca109細胞增殖率差異無統計學意義[(100.00±0)%vs(101.23±5.20)%，P>0.05]；與對照組相比，miR-15b mimic組Eca109細胞增殖率顯著降低[(64.57±6.11)%vs(100.00±0)%，P<0.05]；與miR-15b mimic組相比，miR-15b mimic+pcDNA3.1組Eca109細胞增殖率差異無統計學意義[(65.14±5.19)%vs(64.57±6.11)%，P>0.05]，miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組細胞增殖率明顯升高[(90.62±7.07)%vs(64.57±6.11)%，P<0.05]。

2.3 Eca109細胞的遷移能力劃痕實驗結果顯示，對照組和miR-NC組的劃痕愈合率差異無統計學意義[(63.45±7.20)%vs(61.83±7.16)%，P>0.05]；與對照組相比，miR-15b mimic組的劃痕愈合率顯著降低[(36.52±4.29)%vs(63.45±7.20)%，P<0.05]；與miR-15b mimic組相比，miR-15b mimic+pcDNA3.1組劃痕愈合率差異無統計學意義[(35.01±4.30)%vs(36.52±4.29)%，P>0.05]，miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組的劃痕愈合率顯著升高[(52.05±5.22)%vs(36.52±4.29)%，P<0.05，圖1]。

圖1 劃痕實驗檢測各組Eca109細胞遷移能力：A.對照組；B.miR-NC組；C.miR-15b mimic組；D.miR-15b mimic+pcDNA3.1組；E.miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組

2.4 各組Eca109細胞的侵襲能力Transwell侵襲實驗結果顯示，對照組和miR-NC組Eca109細胞進入Transwell小室下層的數量差異無統計學意義(155.31±14.23vs158.46±15.71，P>0.05)；與對照組相比，miR-15b mimic組Eca109細胞進入Transwell小室下層的數量顯著降低(101.33±11.45vs155.31±14.23，P<0.05)；與miR-15b mimic組相比，miR-15b mimic+pcDNA3.1組Eca109細胞進入Transwell小室下層的數量差異無統計學意義(100.51±12.34vs101.33±11.45，P>0.05)，miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組Eca109細胞進入Transwell小室下層的數量顯著增加(132.88±13.02vs101.33±11.45，P<0.05，圖2)。

圖2 Transwell小室實驗檢測各組Eca109細胞侵襲能力：A.對照組；B.miR-NC組；C.miR-15b mimic組；D.miR-15b mimic+pcDNA3.1組；E.miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組

2.5 各組Eca109細胞LPAR3以及增殖、遷移與侵襲相關蛋白的表達Western blot結果顯示，對照組和miR-NC組Eca109細胞LPAR3、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組相比，miR-15b mimic組Eca109細胞中LPAR3、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與miR-15b mimic組相比，miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組Eca109細胞上述蛋白表達明顯升高(表3，圖3)。

圖3 各組Eca109細胞LPAR3和Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達：A.對照組；B.miR-NC組；C.miR-15b mimic組；D.miR-15b mimic+pcDNA3.1組；E.miR-15b mimic+pcDNA-LPAR3組

表3 各組Eca109細胞LPAR3和Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達

3 討論

miRNA作為各種腫瘤的潛在治療靶標，越來越受到重視[11-12]。miR-15b是位于染色體3q25上的重要RNA分子[13]。文獻報道，miR-15b可抑制神經母細胞瘤[14]、子宮頸癌[4,15]和子宮內膜癌[5,16]腫瘤細胞的惡性生物學行為。有研究者發現從食管癌患者中分離出的外周血單核細胞中miR-15b水平顯著低于健康志愿者；且miR-15b表達與食管癌腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、纖維膜浸潤和組織學分級顯著相關[8-9]。本實驗通過體外實驗比較人正常食管上皮細胞HEEpiC和人食管癌細胞Eca109中miR-15b的表達，結果顯示Eca109細胞中miR-15b水平顯著低于HEEpiC細胞，與文獻報道一致；而miR-15b過表達可抑制細Cyclin D1、MMP-2和MMP-9的表達，抑制食管癌細胞的增殖活力、遷移和侵襲能力，提示miR-15b可能在食管癌中起抑癌作用。

LPAR3屬于典型的LPA受體，與LPAR1、LPAR2不同，LPAR3在正常組織中較少表達；而在腫瘤組織中表達上調，可影響腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等過程[17-19]。Shi等[10]發現circRNA LPAR3可激活PI3K/Akt通路，在體、內外促進食管鱗狀細胞癌細胞的遷移、侵襲和轉移。王亞莉等[17]發現miR-218-5p可通過靶向下調LPAR3抑制子宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。LPAR3已被證明是miR-15b的靶基因[5]。本組發現與HEEpiC細胞相比，Eca109細胞中miR-15b表達降低的同時伴LPAR3 mRNA水平的升高，通過miR-15b mimic轉染上調miR-15b后，LPAR3 mRNA和蛋白水平降低；為進一步驗證miR-15b過表達是否以LPAR3依賴性方式影響Eca109細胞的生物學行為，本組將miR-15b mimic和pcDNA-LPAR3共轉染了Eca109細胞，發現共轉染組與miR-15b mimic組相比，Eca109細胞中LPAR3的表達顯著增加，同時細胞中Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達均增加，可顯著減弱miR-15b mimic對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制能力。這提示miR-15b可能通過下調LPAR3，抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，過表達miR-15b可能通過下調LPAR3，抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本實驗從體外細胞水平進行初步分析，由于體內外腫瘤微環境存在差異，尚需進行體內動物實驗進一步明確miR-15b對食管癌的影響。