乳腺導管原位癌三級淋巴結構的臨床病理特征分析及其與腫瘤進展的關系

黃東東，鄔萬新,，陳彩萍，左志博，張 琳，王 振，郭志琴，袁琳娜，汪靜宇

乳腺浸潤性導管癌(infiltrating ductal carcinoma, IDC)是由導管原位癌(ductal carcinoma in situ, DCIS)經過微小浸潤性癌(ductal carcinoma in situ with microinvasion, DCIS-MI)發展而來[1-2]。在DCIS發展成IDC的過程中，宿主局部免疫功能起著重要作用，三級淋巴結構(tertiary lymphoid structures, TLS)就是其中重要的免疫功能結構[3-4]。目前，對于TLS在乳腺DCIS浸潤和進展過程中的作用尚不明確。因此，本文著重探討乳腺DCIS中TLS的臨床病理特征，分析其與腫瘤浸潤的關系，為臨床與病理醫師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集嘉興市第一醫院2011年12月～2017年12月收治的103例DCIS、32例DCIS-MI和78例IDC手術標本。所有病例均經病理確診，術前未接受放、化療且有臨床隨訪資料。隨訪截至2021年4月30日。DCIS和DCIS-MI患者隨訪3～108個月(中位隨訪時間68個月)，平均年齡(53.85±9.72)歲；IDC患者隨訪6～112個月(中位隨訪時間56個月)，平均年齡(54.69±10.94)歲。

1.2 方法

1.2.1組織學分組及分型 參照WHO(2019)乳腺腫瘤分類的標準分別定義DCIS、DCIS-MI和IDC及進行分子分型[5]。乳腺癌分子分型為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和三陰型。

1.2.2免疫組化 采用EnVision兩步法行免疫組化染色。主要試劑：CD3(兔單抗，EP41，1∶100)、CD21(兔單抗，EP64，1∶200)和BCL-6(鼠單抗，ZM-0011，1∶200)購自北京中杉金橋公司；CD20(鼠單抗，L26，即用型)購自福州邁新公司；PNAD(鼠單抗，MECA-79，1∶50)購自美國SANTA CRUZ公司。采用已知的陽性或內對照組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。應用全自動免疫組化儀(Roche Benchmark XT, USA)執行免疫組化染色流程。

1.3 結果判讀TLS判讀標準：(1)判讀區為癌灶內及其周圍≤5 mm間質區域；(2)出現淋巴細胞聚集灶，且有CD3和CD20陽性細胞；(3)聚集灶內可見高內皮小靜脈(high endothelial venules, HEV)，且PNAD陽性；(4)聚集灶內伴或不伴生發中心，有或無CD21陽性濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cell, FDC)、BCL-6陽性生發中心細胞 (germinal center cell, GC)[6-7]。

TLS密度分級：(1)在DCIS及DCIS-MI中，將TLS按照導管周圍含有TLS的導管數量占DCIS總導管數量的百分比進行分級：無、低(含TLS的DCIS導管<10%)、中等(含TLS的DCIS導管10%～50%)、高(含TLS的DCIS導管>50%)[6-7]。(2)在IDC中，以TLS占據癌灶周長的百分比進行分級：無、低(TLS占據癌灶周長<10%)、中等(TLS占據癌灶周長10%～50%)、高(TLS占據癌灶周長>50%)[6,8]。

1.3 統計學方法所有數據采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。組間差異比較采用Pearson χ2檢驗或Fisher精確概率方法。生存分析采用Kaplan-Meier。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLS的特征及在DCIS、DCIS-MI和IDC中的分布在DCIS、DCIS-MI和IDC中，TLS均以淋巴細胞聚集灶形式存在，CD3+細胞圍繞TLS周邊，CD20+細胞主要位于GC及套區，PNAD+HEV存在于TLS內部(圖1)。TLS在DCIS和DCIS-MI中主要分布于導管周圍，在IDC中主要分布于浸潤灶周邊。

圖1 同一導管原位癌病例連續切片：A. TLS的組織結構，HE染色；B.CD3+T淋巴細胞，EnVision兩步法；C.CD20+B淋巴細胞，EnVision兩步法；D. CD21+濾泡樹突狀細胞，EnVision兩步法；E. BCL-6+生發中心細胞，EnVision兩步法；F. PNAD+高內皮小靜脈，EnVision兩步法

2.2 TLS與DCIS、DCIS-MI和IDC臨床病理特征的關系103例DCIS中，不同核級組間TLS密度差異有統計學意義(P<0.001，表1)，隨著核級的增高DCIS中TLS高密度數增高。DCIS伴有壞死組較無壞死組的TLS高密度數增高(χ2=41.127，P<0.001)。DCIS不同分子分型組間TLS密度差異有統計學意義(P<0.001)，其中HER-2過表達型DCIS中TLS高密度比例最高。32例DCIS-MI中，不同分子分型(P=0.019)、核級(P=0.007)分組間TLS密度差異有統計學意義，隨核級的增高DCIS中TLS高密度數增高(表1)。

表1 TLS密度與乳腺導管原位癌及乳腺導管原位癌伴微浸潤臨床病理特征的關系

TLS在DCIS中的發生率78.6%(81/103)，在DCIS-MI中的發生率96.9%(31/32)，兩組差異有統計學意義(χ2=21.680，P<0.001)，且在DCIS-MI中高于DCIS。

78例IDC中，不同組織學分級(P<0.001)、核級(P=0.016)、腫瘤直徑(P<0.001)、淋巴結轉移(P=0.043)和分子分型(P=0.001)分組間差異有統計學意義，并隨組織學分級增高、核級增高、腫瘤體積增大和淋巴結轉移時TLS密度增高，其中HER-2過表達型IDC中TLS高密度比例最高(表2)。

表2 TLS密度與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系

2.3 TLS與乳腺癌患者預后的關系三組病例臨床隨訪中均無局部復發。DCIS和DCIS-MI組有3例發生肺或骨轉移，2例死于乳腺癌。IDC組有5例發生肺、骨或腦轉移，3例死于乳腺癌。生存分析顯示：在DCIS及DCIS-MI中(圖2A)，有TLS組和無TLS組患者的5年生存率分別是99.3%和100.0%，差異無統計學意義(P=0.518)。在IDC中(圖2B)，有TLS組和無TLS組患者的5年生存率分別是94.2%和100.0%，差異無統計學意義(P=0.220)。

圖2 A.有TLS組和無TLS組的乳腺導管原位癌、乳腺導管原位癌伴微浸潤患者的生存率；B.有TLS組和無TLS組的浸潤性導管癌患者的生存率

3 討論

TLS是在原沒有淋巴組織聚集的部位出現的一種獲得性免疫功能結構，目前認為它是腫瘤局部免疫的關鍵因素[3]。本研究中78.6%DCIS的導管周圍存在密度不等的TLS，且隨著DCIS核級的增高或伴有壞死時，導管周圍TLS的密度增大。Pruneri等[9]發現DCIS中64.8%病例的導管周圍存在不同程度的淋巴細胞浸潤，并且DCIS的核級越高，出現圍管型淋巴細胞浸潤現象越明顯。同時，有研究[10-11]在對DCIS免疫微環境的研究中發現：導管周圍淋巴細胞浸潤與腫瘤細胞基因組高拷貝數和p53突變有關，此類腫瘤細胞較易產生新的腫瘤抗原，吸引免疫細胞的浸潤，并在形態學上其常表現為高核級和壞死改變。

本組中96.9%的DCIS-MI導管周圍存在TLS，密度明顯高于DCIS組；其中DCIS成分大部分是高核級，表明大多數DCIS-MI來自高核級DCIS，且伴隨導管周圍TLS密度增加，微小浸潤癌發生率也增加。Beguinot等[12]在研究DCIS和DCIS-MI關系時發現：DCIS存在2種不同亞型，其中伴有高密度淋巴細胞浸潤的DCIS在生物學上與DCIS-MI類似，認為DCIS-MI更多的是來自于伴有淋巴細胞浸潤的DCIS。Kim等[7]在對DCIS-MI的研究中同樣發現TLS數量明顯多于單純性DCIS。Yuan等[13]在對乳腺癌的研究中發現，癌灶局部浸潤的淋巴細胞對肌上皮具有破壞作用，利于腫瘤細胞浸潤的發生。因此，TLS可能與DCIS腫瘤細胞早期浸潤的發生有關。

本組IDC病例隨著癌灶周圍TLS密度的增加，腫瘤的組織學分級增高，體積增大，并更易出現淋巴結轉移，提示TLS可能與乳腺癌組織學不良預后因素相關。Toss等[14]在192例同時含有IDC與DCIS成分的乳腺癌病例中發現，浸潤性癌區域出現了高密度的淋巴細胞浸潤。Sofopoulos等[15]隨訪了112例乳腺IDC患者，與缺乏TLS的患者相比，瘤周存在TLS患者的無瘤生存期和總生存期均較差，認為TLS是預后不良的因素。

在乳腺癌分子分型與TLS密度關系中，DCIS和IDC中HER-2過表達型病例的TLS密度均高于其他亞型，提示HER-2陽性癌細胞可能更易激活免疫系統反應，在癌灶局部產生TLS。Kim等[7]研究也發現TLS與HER-2過表達/激素受體陰性表型有關。HER-2過表達型乳腺癌出現較多TLS的原因，可能與此型乳腺癌表達可吸引免疫細胞浸潤的HMGB1和HMGN1蛋白有關[16]。

目前，有關TLS與乳腺癌患者預后關系的研究結果尚不一致。有研究表明IDC瘤周存在的TLS是預后不良因素[17]；但在三陰型或HER-2過表達型乳腺癌的研究中發現TLS是預后良好指標[6,17]。這些差異可能與上述研究所涉及的乳腺癌類型不同有關，TLS常見于三陰型或HER-2過表達型的高侵襲性乳腺癌，當與低侵襲類型乳腺癌比較預后時，可能癌細胞本身起決定性作用；而在同一類型乳腺癌中，TLS就可能成為預后有利的因素。本研究未觀察到TLS對乳腺癌預后的影響，可能與樣本量少和隨訪時間有限有關。

綜上，乳腺DCIS出現高核級、壞死和HER-2過表達時常伴有TLS的形成，并且TLS與DCIS早期浸潤相關。進一步研究DCIS導管周圍TLS的免疫細胞組成及效應關系，可為乳腺癌早期抑制腫瘤進展方面提供新的思路。