結直腸癌中NAT10與上皮-間質轉化的關系

劉英竹，程先碩，蔡昕怡，羅 含，江 凡，張麗娟

結直腸癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤，近年來其發病率和病死率在全球范圍內均呈上升趨勢。2020年全球癌癥統計報告顯示，結直腸癌的發病率位居第3位，病死率位居第2位[1]。流行病學調查顯示，復發和轉移是結直腸癌患者預后不良的關鍵性因素。腫瘤局限于結直腸的結直腸癌患者5年生存率約90%，而發生淋巴結或遠處轉移患者的5年生存率則會大幅降低[2]。腫瘤轉移是一個涉及多基因變化的一系列復雜過程，其中上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)使其從原發灶脫落而更具侵襲性，是其發生遠處轉移的關鍵步驟，是腫瘤侵襲轉移的重要機制，其過程涉及包括Wnt通路在內的多條信號通路。目前已有研究證實[3]，結直腸癌的復發轉移與EMT密切相關。N-乙酰基轉移酶10(N-acetyltransferase 10, NAT10)是一種廣泛存在于細胞內，由1 025個氨基酸組成的核蛋白，包含1個乙酰基轉移酶結構域和1個富含賴氨酸的羧基末端。NAT10在正常組織中表達定位于核仁中；而在腫瘤細胞中，NAT10存在易位表達如細胞核、細胞質、細胞膜。目前已有研究表明[4]，NAT10表達上調可促使EMT進而導致肝細胞性肝癌的轉移。然而，NAT10在結直腸癌中研究甚少。因此，本實驗采用免疫組化法檢測NAT10、E-cadherin、β-catenin、vimentin在結直腸癌中的表達，探究NAT10表達與結直腸癌EMT的相關性及與臨床病理特征的關系，旨在為探索結直腸癌患者新的抗腫瘤治療方法提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集云南省腫瘤醫院2016年8月～2021年9月存檔的原發性結直腸腺癌根治性標本95例作為實驗組，30例癌旁正常組織(距離癌組織5 cm以上的正常腸黏膜組織)作為對照組。95例結直腸腺癌中，男性55例，女性40例；<50歲者21例，≥50歲者74例；高+中分化62例，低分化33例；腫瘤浸潤至T1(黏膜下層)14例，T2(固有肌層)34例，T3(漿膜下層)有46例，T4(穿透漿膜層)1例；淋巴結轉移：N0(無淋巴結轉移)48例，N1(淋巴結轉移數3枚及以下)34例，N2(淋巴結轉移數4枚及以上)13例；pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期44例，Ⅲ+Ⅳ期51例；無脈管內癌栓或神經侵犯57例，有脈管內癌栓或神經侵犯38例；無遠處轉移80例，有遠處轉移15例。入組標準：(1)經病理診斷證實初診為結直腸腺癌的根治術術后標本；(2)患者術前未行放、化療及靶向治療；(3)未合并其它惡性腫瘤；(4)有完整的臨床病理資料。

1.2 主要試劑E-cadherin、β-catenin、vimentin鼠抗人單克隆抗體均購自福州邁新公司，免疫化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。NAT10購自Abcam公司。

1.3 免疫組化標本均經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚切片。NAT10抗體為濃縮液，1∶2 000比例稀釋。將已知陽性組織切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。一抗包括NAT10、E-cadherin、β-catenin、vimentin，免疫組化采用MaxVision 3HRP法，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判讀

1.4.1NAT10判讀 NAT10在正常結直腸黏膜組織中表達定位于細胞核核仁，因此當≥10%的結直腸腺癌細胞呈細胞質、細胞核及細胞膜易位表達時，即判定為陽性[5]。

1.4.2E-cadherin、vimentin判讀 觀察高倍(400×)視野下陽性細胞數及染色強度。隨機選取5個高倍視野，計數至少200個細胞。細胞未染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐為3分。總評分=不同染色狀態的細胞數×對應的染色評分。將E-cadherin評分<200稱為表達下降，將vimentin評分>30稱為表達上調。本實驗將E-cadherin表達下降稱為陰性，反之稱為E-cadherin陽性；將vimentin表達上調稱為陽性，反之稱為vimentin陰性。結果判定由2名醫師采用雙盲法讀片確定。

1.4.3β-catenin判讀 β-catenin在正常結直腸黏膜組織中表達定位于細胞膜，在結直腸腺癌中存在細胞質及細胞核異位表達。本實驗采用Maruyama等[6]的方法，即當10%及以上的細胞出現細胞核或細胞質表達時稱為異位表達，即陽性；反之則為陰性。

1.5 統計學分析采用SPSS 26.0軟件進行統計學處理，計數資料的比較采用χ2檢驗或費希爾精確檢驗，采用斯皮爾曼對NAT10及EMT相關標志蛋白的表達進行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸腺癌和正常腸黏膜組織中NAT10的表達在30例正常腸黏膜組織中，有90%(27/30)的NAT10表達定位于細胞核核仁(圖1)；在95例結直腸腺癌組織中，有70.5%(67/95)出現細胞核及細胞質陽性(圖2)，29.5%(28/95)為陰性或細胞核核仁陽性。

2.2 結直腸腺癌與正常腸黏膜組織中E-cadherin、β-catenin、vimentin的表達結直腸癌組織中E-cadherin呈陽性(圖3)，陽性率為56.8%(54/95)；在正常腸黏膜組織中，E-cadherin陽性率為96.7%(29/30)，結直腸癌組織中E-cadherin的陽性率明顯低于正常腸黏膜組織(P<0.001)。結直腸癌組織中β-catenin呈陽性(圖4)，陽性率為74.7%(71/95)；在正常腸黏膜組織中，β-catenin陽性率為0(0/30)，結直腸癌組織中β-catenin陽性率明顯高于正常腸黏膜組織(P<0.001)。結直腸癌組織中vimentin呈陽性(圖5)，陽性率為35.8%(34/95)；在正常腸黏膜組織中vimentin陽性率為0(0/30)，結直腸癌組織中vimentin陽性率明顯高于正常腸黏膜組織(P<0.001，表1)。

表1 結直腸腺癌及正常腸黏膜組織中E-cadherin、β-catenin及vimentin的表達

2.3 結直腸腺癌中NAT10與E-cadherin、β-catenin、vimentin表達的相關性在結直腸腺癌組織中，E-cadherin、β-catenin、vimentin的陽性率分別是56.8%、74.7%、35.8%。相關性分析顯示，NAT10與E-cadherin表達呈負相關，與vimentin、β-catenin表達呈正相關(表2)。

表2 結直腸腺癌中NAT10與E-cadherin、β-catenin及vimentin表達的相關性

2.4 結直腸腺癌中NAT10表達與臨床病理特征的關系NAT10表達與結直腸腺癌分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度及pTNM分期相關(P<0.05)，與患者年齡、性別、神經及脈管侵犯、遠處轉移均無關(P>0.05，表3)。

表3 結直腸腺癌中NAT10表達與臨床病理特征的關系

3 討論

NAT10是乙酰基轉移酶GCN5相關N端乙酰基轉移酶超家族成員，具有組蛋白和非組蛋白乙酰基轉移酶功能[7]。近年來，研究顯示NAT10參與人體內的若干種生理及病理生理過程，如調控mRNA穩定性及翻譯效率、調控端粒酶活性、調控細胞周期進展等，且在細胞增殖、細胞遷移、DNA損傷反應和EMT中均有作用，因此NAT10可能是治療癌癥的潛在靶點[8-9]。NAT10在淋巴組織、腎臟、肝臟、小腦、大腦皮層和胚胎時期的中樞神經系統等組織中廣泛表達。在功能正常的細胞中，其表達定位于核仁；在腫瘤組織中，其存在易位表達，常位于細胞核、細胞質等。這種易位表達機制尚不完全清楚，可能是由同時缺失68-75、989-1018兩個基因片段所導致[10]。

Zhang等[5]研究表明，NAT10過表達可增加結直腸癌細胞活動度，促進腫瘤侵襲、轉移，與結直腸癌預后關系密切，且NAT10的易位表達模式也與結直腸癌分化程度及預后相關。低分化、預后差的結直腸腺癌中，NAT10更傾向于細胞膜表達；而中+高分化、預后相對較好的結直腸腺癌傾向細胞質、細胞核表達及聯合表達。這種易位表達與預后的相關性在透明性腎細胞癌、肝細胞性肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、軟組織肉瘤中曾得到證實[11]。但也有研究表明[12]，結直腸癌組織中NAT10表達水平較正常組織明顯降低，且在結直腸腺癌、胃腺癌、胰腺腺癌中，NAT10水平與E-cadherin水平呈正相關。本實驗與Zhang等[5]的研究結論一致，認為NAT10過表達可增加結直腸癌細胞活動度，但本實驗中并未出現細胞膜的表達模式，可能與病例數較少和組織差異有關。

在生理狀態下，正常組織中上皮細胞間具有強大的黏附能力，使其緊密相連，難以發生轉移。而當上皮細胞喪失了原來特性，轉化為疏松排列的具有間質細胞特性的細胞時，EMT就此產生，其是腫瘤突破基膜，發生轉移的重要步驟。有研究表明[13-14]，EMT在多種惡性腫瘤如結直腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、肝細胞性肝癌、骨肉瘤、多發性骨髓瘤、舌鱗狀細胞癌中均有發生。在宏觀方面，EMT表現為細胞形狀的改變，由原先排列緊湊的圓形或立方形上皮細胞變為排列疏松的梭形細胞，并伴有遷移游走能力增強。微觀表現為上皮表型標志物如：E-cadherin、膜性β-catenin的表達減少，同時間質細胞分子標志物如vimentin、N-cadherin、MMPs等表達增加。其中β-catenin核異位可負性調控膜相關性E-cadherin/β-catenin復合物，使腫瘤細胞間的黏附能力下降，從而增強腫瘤細胞侵襲轉移能力。本實驗中，與正常腸黏膜組織相比，結直腸腺癌組織中E-cadherin表達降低，vimentin及β-catenin表達增加且差異具有統計學意義。

在肝細胞性肝癌中，有研究發現[4]通過轉染NAT10-siRNA或Remodelin處理抑制NAT10活性后，腫瘤細胞成瘤能力減低，同時E-cadherin表達升高，而vimentin表達下降，表明下調NAT10表達可抑制EMT的發生發展。此外，在乳腺癌[15]中也可得到類似結論：即用Remodelin抑制劑處理NAT10后，發現E-cadherin表達升高，而vimentin表達降低。Zhang等[5]研究表明，在結直腸癌中存在胞質、胞核、胞膜的NAT10染色與β-catenin的細胞核易位表達呈正相關。本實驗雖然未出現NAT10的膜性表達，但NAT10易位表達與β-catenin異位表達間存在顯著正相關；NAT10表達與結直腸癌分化程度、浸潤深度、pTNM分期和淋巴結轉移相關，進一步說明了結直腸癌中NAT10與EMT間存在顯著相關性，與既往研究相符。

綜上，NAT10在結直腸腺癌中存在顯著的易位改變，并與EMT間存在正相關。NAT10通過誘導結直腸癌EMT，從而促進腫瘤細胞侵襲、轉移，但其中涉及的分子、通路由于相關研究較少，尚不十分清楚，有待于進一步探索。目前已存在的NAT10小分子抑制劑Remodelin對NAT10的活性具有明顯的抑制作用，已在體外肝細胞性肝癌及乳腺癌細胞株中被證實，且已應用于臨床基礎研究中，有望向臨床轉化應用。結直腸腺癌的治療手段雖然比較廣泛，但復發、轉移仍是預后不良的關鍵性因素和主要死因。因此，深入探究NAT10在結直腸癌中侵襲轉移的分子機制在未來結直腸癌的臨床治療中具有重要意義。