甲苯胺藍(lán)快速染色法在乳腺癌及甲狀腺乳頭狀癌冷凍切片診斷中的應(yīng)用

胡少為，董杏梅，李楚天

甲苯胺藍(lán)(toluidine blue, TB)是一種在結(jié)構(gòu)上與亞甲藍(lán)和苯胺藍(lán)A相似的嗜酸性噻嗪類堿性染料，溶于水和乙醇，與細(xì)胞中DNA和RNA的酸性基團(tuán)(包括羧酸、硫酸、磷酸鹽等基團(tuán))有著較強(qiáng)的親和性，是一種人工合成的核酸染色劑。腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA合成量顯著增多，因此TB在腫瘤細(xì)胞更易著色，且著色時(shí)間久，其著色程度也可反映細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的含量[1]。目前TB染色已被廣泛應(yīng)用于子宮頸、口腔、咽喉、食管、胃腸等部位惡性腫瘤的活體檢查，及肥大細(xì)胞[2]和幽門螺桿菌[3]的特殊染色中。本科室在冷凍切片染色的探索實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)TB可以用于術(shù)中診斷乳腺癌及甲狀腺乳頭狀癌的冷凍切片染色，其細(xì)胞染色對(duì)比鮮明，能清晰的顯示組織的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)操作步驟更簡(jiǎn)單、快速，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019～2021年廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)院病理科存檔的40例乳腺癌和30例甲狀腺乳頭狀癌。乳腺癌患者均為女性，年齡33～65歲，均為乳腺浸潤(rùn)性癌(非特殊類型)。甲狀腺乳頭狀癌中，男性8例，女性22例，年齡22～60歲。

1.2 主要試劑及配制將0.5 g TB完全溶解于100 mL蒸餾水中，配成0.5 g/dL TB溶液。

1.3 方法將6 μm厚新鮮標(biāo)本冷凍切片吸附于載玻片上，快速放入甲醇溶液內(nèi)上下振動(dòng)3～5次，取出玻片，在裝有流水的器皿內(nèi)快速振動(dòng)3～5次，再放入0.5 g/dL TB溶液中染色10～20 s，取出玻片，于裝有流水的器皿內(nèi)快速振動(dòng)2～3次，蓋玻片封片，用濾紙吸掉多余的水。

用于保存的冷凍切片需用丙三醇封片保存，再次閱片時(shí)可揭下蓋玻片，流水沖洗，放入TB溶液中重染10～20 s，在裝有流水的器皿內(nèi)快速振動(dòng)2～3次，蓋玻片封片即可。

2 結(jié)果

鏡下見不同細(xì)胞經(jīng)TB染色呈不同強(qiáng)度的藍(lán)色，因此可以較好地辨別不同組織的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。正常乳腺整個(gè)導(dǎo)管-小葉系統(tǒng)被覆的細(xì)胞為雙層結(jié)構(gòu)，即內(nèi)層(腺腔面)上皮細(xì)胞層和外層(基底面)肌上皮細(xì)胞層，導(dǎo)管上皮細(xì)胞呈立方狀或柱狀，外層圍繞的肌上皮細(xì)胞胞核梭形或短梭形。導(dǎo)管原位癌及導(dǎo)管上皮不典型增生TB染色示腺腔內(nèi)上皮細(xì)胞呈淺藍(lán)色，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核體積增大、染色質(zhì)淡染，可見核分裂象，導(dǎo)管周圍肌上皮細(xì)胞胞核呈深藍(lán)色。浸潤(rùn)性癌細(xì)胞呈腺管、片狀或條索狀生長(zhǎng)，細(xì)胞核體積增大、淡染，周圍未見深染的肌上皮細(xì)胞。在本組40例乳腺癌組織冷凍切片上，TB染色顯示的正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、導(dǎo)管原位癌細(xì)胞及浸潤(rùn)性癌細(xì)胞染色強(qiáng)度對(duì)比鮮明，結(jié)果穩(wěn)定(圖1、2)。

甲狀腺乳頭狀癌組織冷凍切片經(jīng)TB染色可以清晰地顯示甲狀腺乳頭狀癌的乳頭呈分枝狀，具有纖細(xì)的血管軸心，被覆單層或復(fù)層立方細(xì)胞，細(xì)胞排列擁擠、重疊，細(xì)胞核增大，細(xì)胞核毛玻璃樣，核膜增厚，核仁不明顯，細(xì)胞核內(nèi)易見深核溝及核內(nèi)假包涵體，局灶可見鈣化(圖3～5)，并與周圍正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞形態(tài)形成鮮明對(duì)比。周圍正常甲狀腺由大小不一的圓形或卵圓形濾泡構(gòu)成，濾泡內(nèi)襯單層濾泡上皮細(xì)胞，細(xì)胞呈扁平或矮柱狀，濾泡上皮細(xì)胞核深染，染色質(zhì)濃縮。

3 討論

TB是一種常用的醌亞胺類堿性染料，包含胺基、醌型苯環(huán)2個(gè)發(fā)色團(tuán)與2個(gè)助色團(tuán)，助色團(tuán)促使染料電離成陽(yáng)離子鹽類，陽(yáng)離子幫助發(fā)色團(tuán)對(duì)組織及其他被染物細(xì)胞中的酸性物質(zhì)產(chǎn)生親和力，使切片上的組織及細(xì)胞核染成藍(lán)色[4]。

目前，TB染色已被廣泛應(yīng)用于口腔癌前病變或口腔鱗狀細(xì)胞癌[5]，頭頸部、食管、外陰、女性生殖系統(tǒng)的子宮內(nèi)膜復(fù)雜性增生伴不典型性、子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變[6]、陰道細(xì)胞學(xué)檢測(cè)及胃癌及胃癌癌前病變[7]的上消化道惡性腫瘤等的研究中，還用于生殖道感染的病原菌、胃黏膜活檢組織切片幽門螺桿菌(HP)，組織中的組織細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血管、紅細(xì)胞和膠原纖維的染色。因其經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，已受國(guó)內(nèi)外專家的關(guān)注，并被廣泛應(yīng)用于許多臨床工作中。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TB染色在冷凍切片診斷乳腺癌及甲狀腺乳頭狀癌中也有很多優(yōu)點(diǎn)。正常乳腺整個(gè)導(dǎo)管-小葉系統(tǒng)由上皮細(xì)胞層和肌上皮細(xì)胞層組成，這種雙層結(jié)構(gòu)對(duì)乳腺病理診斷極其重要，它是區(qū)分良、惡性病變的主要指標(biāo)之一。由于肌上皮細(xì)胞經(jīng)TB染色呈深藍(lán)色，在冷凍切片上易見，且與導(dǎo)管上皮染色對(duì)比鮮明，這樣能較好地明確增生的導(dǎo)管上皮周圍有無(wú)肌上皮細(xì)胞，對(duì)乳腺浸潤(rùn)性癌的診斷提供明確的診斷依據(jù)。因此，導(dǎo)管原位癌病變時(shí)，導(dǎo)管上皮呈實(shí)體型、篩狀或粉刺狀等不同的形態(tài)生長(zhǎng)，經(jīng)TB染色異型的導(dǎo)管上皮細(xì)胞核淡染，周圍肌上皮細(xì)胞核深染。浸潤(rùn)性癌細(xì)胞胞核淡染，周邊缺失深染的肌上皮細(xì)胞。而且，TB染色能夠較好地顯示細(xì)胞核的染色質(zhì)情況，乳腺癌細(xì)胞核淡染、顆粒狀，與正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞的染色明顯不同，正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞核染色相對(duì)較深，染色質(zhì)細(xì)膩。

在甲狀腺乳頭狀癌組織冷凍切片中，TB染色可更清晰地顯示出甲狀腺乳頭狀癌組織學(xué)及細(xì)胞核特征，這些特征是診斷甲狀腺乳頭狀癌的必要條件。

在技術(shù)操作上，TB染色較傳統(tǒng)染色也有很多優(yōu)點(diǎn)，且值得提倡和推廣。TB染色突出的優(yōu)點(diǎn)有：(1)染色快速，僅需50～60 s，操作簡(jiǎn)便，顯著縮短冷凍切片染色時(shí)間；(2)經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，僅需0.5 g/dL TB，節(jié)約成本，易推廣，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值；(3)染色效果好且穩(wěn)定，能清楚地辨別乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞，尤其是明確浸潤(rùn)情況及甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞核的典型特征，顯著提高冷凍病理診斷準(zhǔn)確率；(4)甘油封片易于冷凍切片保存，可有效防治干片。

TB染色方法簡(jiǎn)便、快速，可作為術(shù)中診斷乳腺癌及甲狀腺乳頭狀癌的常用輔助染色方法，可提高術(shù)中冷凍切片病理診斷的的精準(zhǔn)度，有一定的實(shí)用價(jià)值。