不同分級指數燕麥干草對奶牛體外發酵營養物質降解率、瘤胃發酵參數和微生物組成的影響

陳雅坤， 劉 佳， 王思偉， 孟憲華， 王 昆， 張建勇， 楊麗萍， 沈旖帆， 趙連生

（1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所/動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；2.北京市獸藥飼料監測中心，北京 102200；3.河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035；4.河北省畜牧總站，河北石家莊 050035；5.寧夏回族自治區畜牧工作站，寧夏銀川 750004；6.云南省飼草飼料工作站，云南昆明 650225）

燕麥草具有產量高、營養價值好、耐干旱、耐嚴寒等特性， 成為目前我國廣泛推廣的禾本科飼草（侯龍魚等，2019）。但由于我國的燕麥草人工草地栽培體系不夠成熟，燕麥草的質量參差不齊（解津剛等，2022；侯龍魚等，2019）。 熊乙等（2018）研究了山西、 甘肅和澳洲等3 個產地的燕麥草營養價值發現， 不同產地燕麥草營養成分存在明顯差異， 澳洲燕麥草中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維較低，山西和甘肅燕麥草粗蛋白質含量較高。劉文婷等（2019）通過在全國燕麥主產區的11 個省研究環境因素和品質性質之間的相關性發現， 蛋白質含量與經緯度呈顯著正相關， 淀粉和脂肪含量與經緯度呈負相關。

粗飼料分級指數（GI）是盧德勛結合我國飼草現狀提出的飼草品質評價方法（紅敏等，2011）。紅敏等（2011）對GI 模型進行驗證、對比發現，GI 與飼料相對價值（RFV）分級的準確性和順序性較為一致，GI 能準確而科學地對粗飼料品質進行分級劃分。 王艷菲等（2013）報道，GI 在評價飼草品質、篩選和優化飼草組合、 指導飼草科學種植等方面得到了廣泛的應用。

燕麥草為反芻動物日糧中重要的粗飼料來源之一（解津剛等，2022）。 因此，掌握其在瘤胃消化吸收規律、 瘤胃微生物組成對提升其降解率具有重要作用。 Henderson 等（2015）研究發現，宿主和飼料是影響瘤胃微生物較大的因素， 其中飼料占主導地位。 Maga 等（2013）同樣發現，反芻動物瘤胃微生物群落結構的大部分變異可歸因于飼料的差異。本試驗以成熟期燕麥干草作為研究對象，通過研究不同分級指數燕麥干草對奶牛營養物質降解率、瘤胃發酵參數和微生物組成的影響，了解其在瘤胃的降解規律， 為其在奶牛飼料配方中科學應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2022 年1 月，分別在甘肅省定西市、 河北省張家口市和內蒙古自治區錫林郭勒盟采集成熟期收割打捆的燕麥干草。 樣品采集流程及方法參照《GB/T 14699-2005》（2005），每種飼草樣品采集300 g 左右。 將采集的飼料65 ℃烘至恒重，回潮4 h 后粉碎，過40 目篩制成風干樣品。參照《飼料分析與檢驗》（王加啟和于建國，2004）進行常規營養成分測定。 參照《GB/T 23387-飼草營養品質評定GI 法》（2009）進行質量分級。 具體營養成分見表1。

1.2 試驗設計 采用單因素設計， 試驗分為3組，試驗1 組、試驗2 組和試驗3 組底物是GI 值分別為4.26、10.98、11.60 MJ/d 的燕麥干草， 其等級分別是五級、三級、三級，每組設置10 個重復，體外發酵24 h。

1.3 動物供體與瘤胃液采集 在中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所昌平試驗基地選取3 頭健康且裝有永久性瘤胃瘺管的泌乳期奶牛作為試驗供體牛。 奶牛每天飼喂和擠奶2 次（07:00 和18:00），自由采食和飲水。 于晨飼后2 h 通過瘤胃瘺管采集3 頭牛瘤胃液，混合后裝入39 ℃預熱處理的保溫瓶中，密封后帶回實驗室，使用滅菌后的4層紗布過濾，同時通入CO2，整個過程于39 ℃水浴鍋中進行。

1.4 體外發酵 參照Menke 等（1988）的方法配制緩沖液，將配制好的緩沖液持續通入CO2，使緩沖液由藍色變為粉紅色， 最后為無色， 并預熱至39 ℃，備用。 準確稱取0.5 g 飼料置于150 mL 厭氧發酵瓶中，接種前將發酵瓶預熱39 ℃。 使用分裝器迅速向每個發酵瓶中加入50 mL 緩沖液和25 mL 瘤胃液，并向每個瓶中通入CO25 s 后，立即用瓶塞密封，置于恒溫培養振蕩器（ZWT211，上海智城分析儀器制作公司）中，體外連續發酵24 h。

1.5 樣品采集及前處理 在體外連續發酵24 h后，迅速將發酵瓶放入冰水浴中終止發酵，經尼龍袋過濾后，立即測定發酵液的pH，然后將一部分發酵液分裝后于-20 ℃冰箱冷凍保存， 用于氨態氮、揮發性脂肪酸（VFA）的測定，另一部分取2 mL 發酵液放入液氮中速凍， 置于-80 ℃冰箱保存，用于微生物分析。將裝有發酵殘渣的尼龍袋清洗干凈后，放入65 ℃烘箱中烘至恒重，用于干物質降解率（DMD）、粗蛋白質降解率（CPD）和中性洗滌纖維降解率（NDFD）的測定。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 營養物質降解率測定 干物質（DM）、粗蛋白質（CP）、中性洗滌纖維（NDF）測定參照《飼料分析與檢驗》（王加啟和于建國，2004）中的方法進行，其中，CP 采用全自動凱氏定氮儀（K1100，山東海能科學儀器有限公司） 測定，NDF 采用全自動纖維分析儀 （Ankom A2000i Fiber Analyzer，美國ANKOM 公司）測定。 飼料中營養物質降解率計算公式如下：

降解率/%=[樣品中營養物質含量（g）-降解后殘渣中營養物質含量 （g）]/樣品中營養物質含量（g）×100。

1.6.2 發酵指標測定 發酵液中pH 采用SartoriusPB-10 型pH 計測定；氨態氮（NH3-N）采用靛酚比色法（2011）測定；VFA 濃度利用氣相色譜儀（Agilent 6890N GC system，Agilent）以外標法測定（王芳等，2016），色譜條件如下：以氮氣為載氣，色譜柱DB-FFAP （30 m×0.25 mm×0.25 μm）， 柱溫70 ℃，3 ℃/min 至125 ℃，再以30 ℃/min 至125 ℃，保持5 min， 進樣口溫度250 ℃， 檢測器溫度280 ℃，恒壓25 kPa，分流比1：20，進樣量20 μL。

1.6.3 瘤胃微生物組成測定 先用E.Z.N.A.Rsoil DNA kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）進行總DNA 抽提， 再用NanoDrop2000 測定DNA 濃度 和 純 度； 使 用 引 物338F （5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對16S rRNA 基 因V3 ～V4 可變區進行PCR擴增， 將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 回收產物純化，用QuantusTMFluorometer （Promega，USA） 對回收產物進行檢測定量。 利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序 （上海美吉生物醫藥科技有限公司）。

1.7 數據處理 對微生物測序結果先用fastp（Chen 等，2018）軟件對原始數據進行質控，再用FLASH（Magoc∨等，2011）軟件進行拼接，然后使用UPARSE（Edgar 等，2013）軟件，根據97%（ Edgar等，2013） 的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體，最后利用RDP classifier（Wang，2007）對每條序列進行物種分類注釋， 對比Silva 16S rRNA 數據庫（v138）。 對營養指標、發酵指標和菌群相對豐度運用Excel 2016 進行數據整理，采用SPSS 17.0 軟件中單因素方差進行分析， 采用Duncan’s 法進行多重比較，0.05≤P< 0.10 表示有顯著趨勢，P< 0.05 表示差異顯著，P< 0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同分級指數燕麥干草對體外營養物質降解率的影響 由表2 可知， 體外發酵24 h 時，試驗2 組和試驗3 組的DMD、CPD 和NDFD 極顯著高于試驗1 組（P＜0.01），DMD 比試驗1 組分別高50.95%和55.37%，CPD 比試驗1 組分別高26.12%和94.32%，NDFD 比試驗1 組分別高54.41%和50.47%。 其中試驗2 組和試驗3 組的DMD 和NDFD 差異不顯著（P＞0.05），而試驗3 組CPD 顯著高于試驗2 組（P＜0.01）。總的來說，試驗2 組和試驗3 組營養物質降解率明顯高于試驗1 組。

2.2 不同分級指數燕麥干草對瘤胃發酵參數的影響 由表3 可知，在發酵24 h，各試驗組中pH、異丁酸、異戊酸差異不顯著（P＞0.05），而氨態氮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、TVFA 和乙酸/丙酸差異顯著（P＜0.05），且試驗2 組和試驗3 組氨態氮、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 顯著高于試驗1 組（P＜0.05），除戊酸外，試驗2 組和試驗3 組之間差異不顯著（P＞0.05），其中試驗2 組和試驗3 組氨態氮比試驗1 組分別高10.85%和16.63%，乙酸比試驗1 組分別高12.41%和10.39%， 丙酸比試驗1組分別高19.45%和12.05%，TVFA 比試驗1 組分別高13.39%和11.05%。 總的來說，試驗2 組和試驗3 組瘤胃發酵參數明顯好于試驗1 組。

表3 不同分級指數燕麥干草對瘤胃發酵參數的影響

2.3 不同分級指數燕麥干草對瘤胃菌群數量的影響

2.3.1 瘤胃微生物群落操作分類單元（OTU）聚類和Alpha 多樣性分析 本試驗從12 個瘤胃液樣品中獲得307332 條有效序列， 在3%的距離上，12 個樣本共獲得1981 個OTU， 平均每個樣本有1235.42 個OTU， 所有樣本共有的OTU 數目為618 個。 由表4 可知， 樣本的覆蓋率達到99%以上， 說明測序深度足夠。 其中，3 組OTU 數目、Shannon 指 數、Simpson 指 數、ACE 指 數 和Chaol指數均無顯著差異（P＞0.05）。

表4 燕麥干草體外發酵瘤胃微生物OTU 數目和Alpha 多樣性指數分析

2.3.2 瘤胃微生物群落物種組成分析

2.3.2.1 門水平 本試驗共獲得19 個細菌門分類物種， 燕麥干草各組體外發酵瘤胃微生物優勢菌門相同。 其中， 各組最優勢菌群由擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）組成，兩者占整個菌群89%以上，次級優勢菌群是疣微菌門（Verrucomicrobiota）、纖維桿菌門（Fibrobacterota）、螺旋菌門（Spirochaetota）、變形菌門（Proteobacteria），其余相對豐度低于1%的門類被聚集到一起，試驗1 組、 試驗2 組和試驗3 組分別為2.54%、2.36%和2.52%。

由表5 可知， 試驗2 組和試驗3 組纖維桿菌門相對豐度低于試驗1 組， 比試驗1 組分別低51.36%（P＞0.05）和55.45%（P＜0.05）；其他菌門相對豐度差異不顯著， 但厚壁菌門相對豐度有顯著差異趨勢（P=0.07），從數值上看，試驗2 組和試驗3 組要優于試驗1 組。

表5 不同分級指數燕麥干草對體外發酵瘤胃微生物優勢菌門水平（相對豐度＞1%）的影響%

2.3.2.2 屬水平 本試驗共獲得253 個細菌屬分類物種， 其中最優勢菌屬是普雷沃氏菌屬（Pre-votella） 和 理 研 菌 科RC9 腸 道 群（Rikenellaceae_RC9_gut_group ），兩者均超過15%；次級優勢菌屬15 個， 分別是未知屬F082 菌群（norank_f_F082）、 未知屬擬桿菌目RF16 菌群（norank_f_Bacteroidales_RF16_group）、 琥 珀 酸 菌 屬（Succiniclasticum）、 克里斯滕森菌科R-7 菌群（Christensenellaceae_R-7_group）、 普雷沃氏菌科UCG-003（Prevotellaceae_UCG-003）、未分類理研菌 科（Unclassified_f_Rikenellaceae）、未 知 屬 未 知目WCHB1-41 菌群（Norank_f_norank_o_WCHB1-41）、瘤胃球菌科的特定菌屬（NK4A214_group ）、未知屬UCG-011（Norank_f_UCG-011）、纖維桿菌屬（Fibrobacter）、普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG -001）、 鱗 球 菌 屬 （Sphaerochaeta）、未知屬絨毛桿菌科（Norank_f__Muribaculaceae）、 未知屬-擬桿菌屬UCG-001（norank_f_Bacteroidales_UCG-001）、 毛 螺 菌 科-NK3A20（Lachnospiraceae_NK3A20_ group）， 其相對豐度均低于10%； 其余相對豐度低于1%的菌屬被聚集到一起，試驗1 組、試驗2 組和試驗3 組分別為19.64%、21.05%和20.99%。

由表6 可知，優勢菌屬中，試驗3 組中未分類理研菌科、 未知屬-絨毛桿菌科相對豐度顯著高于試驗1 組和試驗2 組（P＜0.05），試驗2 組和試驗3 組纖維桿菌屬顯著低于試驗1 組（P＜0.05），比試驗1 組分別低51.36%和55.45%； 其他優勢菌屬相對豐度差異不顯著（P＞0.05）。

表6 不同分級指數燕麥干草對體外發酵瘤胃微生物優勢菌屬水平（相對豐度＞1%）的影響%

3 討論

3.1 不同分級指數燕麥干草對體外營養物質降解率的影響 營養物質降解率是評定飼料營養價值的關鍵指標。 DMD 是影響奶牛采食量（DMI）的關鍵因素之一，其代表了被瘤胃微生物利用的能力，DMD 越高， 瘤胃發酵效果就越好，奶牛DMI 就越高，攝入的CP 和能量也就會越多（Lunsin 等，2021；宮福臣等，2013）。在本試驗中，試驗2 組和試驗3 組燕麥干草DMD 顯著高于試驗1 組， 這說明不同分級指數燕麥干草營養價值具有明顯的差異， 這可能與試驗1 組的燕麥干草的蛋白含量低， 中性性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量高有關（陳曉琳等，2014），營養物質含量的差異主要來源于地理環境、品種、收獲時間和加工貯存方式等因素（王吉東等，2022）。

飼料CP 為微生物蛋白合成和瘤胃微生物的生長提供重要的氮源（李小娜等，2012），在本試驗中， 試驗3 組和試驗2 組的CPD 顯著高于試驗1 組， 這可能是由于試驗1 組燕麥干草中CP 含量低，可消化性碳水化合物少，在體外發酵過程微生物蛋白質合成受到限制，CPD 較低（王吉東等，2022）。

飼料中纖維物質有利于奶牛的瘤胃發酵，對于維持奶牛瘤胃的穩態具有重要的作用，因此，奶牛瘤胃中NDFD 是評價燕麥干草營養價值的重要指標， 其值大小反映了纖維物質在瘤胃消化的難易程度 （李勝利等，2014；Oba 等，2006）。在試驗相同的條件下， 提高NDFD 對提高奶牛飼料干物質采食量和產奶量具有顯著的作用，NDF 主要是由纖維素、 半纖維素和木質素等組成，其中半纖維素部分是主要可發酵的成分，而木質素部分結構獨特， 幾乎不會被瘤胃微生物所利用，因此，影響NDFD 主要因素是木質素在NDF 中的比例（李小娜等，2012）。 在本試驗中，試驗2 組和試驗3 組NDFD 燕麥干草顯著高于試驗1 組，這可能是由于GI 等級為五級的燕麥干草的木質化程度較高造成的。 由此可見，相同GI 等級燕麥干草NDFD 差異不顯著， 不同等級燕麥干草NDFD 存在較大差異，GI 分級在實際日糧配方應用過程中可以用作參考。

3.2 不同分級指數燕麥干草對瘤胃發酵參數的影響 pH 是反映瘤胃內環境穩態和發酵狀況的綜合指標， 也是瘤胃微生物正常生長繁殖和發揮功能的必要條件 （鄭宇慧等，2020）， 其值過高、過低對瘤胃發酵、微生物生長與功能均會產生不利影響（王芳等，2016）。 有研究報道，瘤胃液pH 正常范圍是5.5 ～7.5 （Calsamiglia 等，2022）。 在本試驗中， 各組發酵液pH 為6.90 ~6.97，均在正常范圍內，這說明瘤胃緩沖液配制合理，達到了維持體外瘤胃環境穩態的作用（鮑宇紅等，2021；杜超等，2020）。

NH3-N 是評價瘤胃發酵狀況的關鍵指標之一，是飼料蛋白質在瘤胃內降解產物，也是合成瘤胃微生物蛋白的重要前提物質 （蔣辰宇等，2021）。 NH3-N 濃度能夠綜合反映對飼料蛋白質的分解能力和瘤胃微生物對NH3-N 利用的平衡狀 態 （García-gonzález 等，20210）， 瘤 胃 液 中NH3-N 濃度為6 ～30 mg/dL， 其中微生物生長最適范圍為6.30 ～27.50 mg/dL （Wanapat 等，1999）。 在本試驗中， 試驗2 組和試驗3 組的NH3-N 顯著高于試驗1 組，這可能是由于試驗2組和試驗3 組的蛋白含量高， 為瘤胃微生物提供較多的氮源， 使得瘤胃液中的NH3-N 濃度高于試驗1 組，這與本試驗中的粗蛋白質降解規律一致。

VFA 是碳水化合物在瘤胃降解的主要產物，為瘤胃微生物的生長和增殖提供主要的碳架來源（張霞等，2019；Spears 等，2004），能為反芻動物提供60% ～80%的可消化能（王加啟，2011），其大小和組成比例變化可反映了瘤胃的發酵模式和發酵程度的變化。 乙酸是奶牛合成乳脂的主要前體物質， 丙酸是合成葡萄糖的前體物質 （程景等，2021）。在本試驗中，試驗2 組和試驗3 組的乙酸、丙酸和TVFA 含量明顯高于試驗1 組， 可能由于試驗2 組和試驗3 組燕麥干草可溶性碳水化合物較高， 發酵過程中能釋放充足的能量供瘤胃微生物利用，從而促進了瘤胃發酵，產生的VFA 含量增多（張畢陽等，2018）。

3.3 不同分級指數燕麥干草對微生物組成的影響 日糧是影響微生物多樣性的關鍵因素之一，其中組成成分越復雜， 微生物多樣性就越高（Menezes 等，2011）。在本試驗中，各組中OTU 數目、Shannon 指 數、Simpson 指 數、ACE 指 數 和Chaol 指數均無顯著性差異，說明不同GI 值的燕麥干草對總細菌數量、 物種豐富度和瘤胃微生物多樣沒有明顯的影響。 在門水平，本試驗與前人結果類似（李嵐捷等，2017），擬桿菌門和厚壁菌門占主導地位， 且試驗3 組和試驗2 組厚壁菌門比試驗1 組有顯著增加的趨勢， 可能是由于厚壁菌門中含有大量分解飼料中纖維的菌屬， 能夠分解纖維類物質供機體利用 （李嵐捷等，2017）， 這也是造成NDFD 出現差異的主要原因。 在屬水平，普雷沃氏菌屬、理研菌屬琥和珀酸菌屬為奶牛瘤胃內微生物優勢菌屬（Petri等，2019），本研究結果與其類似，但各組差異不顯著。 在本研究中，試驗2 組和試驗3 組低豐度纖維桿菌屬顯著低于試驗1 組， 這可能與燕麥干草中纖維含量不同有關。 有研究表明 （魏園等，2018；Weimer 等，1990）， 當飼料中纖維素含量增加時， 纖維分解菌相應增加。 本試驗還發現，各組中低豐度未分類理研菌科、未知屬-絨毛桿菌科存在顯著差異， 很可能具有某種重要功能，建議對該菌功能進一步挖掘分析，探索該菌是否有助于奶牛瘤胃營養物質的降解。

4 結論

在本試驗條件下， 相同GI 等級燕麥干草營養物質降解率和瘤胃發酵特性沒有顯著差異，但不同GI 等級燕麥干草差異顯著，且隨著GI 等級越高，其瘤胃降解特性越好，營養價值越高。不同分級指數燕麥干草對瘤胃微生物組成沒有顯著影響，但對纖維分解菌、低豐度未分類理研菌科、未知屬-絨毛桿菌科相對豐度具有顯著的影響。