核酸適配體熒光分子開關的啶蟲脒測定

楊麗敏, 李明明

(中國石油大學(華東) 化學工程學院，山東 青島 266580)

0 引 言

近年來，食品安全、環境監測、重大疾病早期診斷等問題日益突出。這些問題是民生，也是政治，關乎社會和諧、國家穩定，更在十三五時期上升為國家重大戰略。為此，現代分析化學的任務已不只限于測定物質的組成及含量，而是需要融合科學前沿，以新的思路、觀念和方式改進目前的分析檢測水平。

核酸適配體(簡稱，適配體)作為一種人工合成的識別分子，具有高特異性、高親和性、便于化學修飾與功能化、易于大規模低成本合成等特點[1-3]。無機離子、有機分子、蛋白質乃至細胞、微生物均可能存在與其對應的適配體。因此，基于適配體的傳感檢測方法已在食品安全、臨床醫療、環境監測等領域得到廣泛應用，成為分析化學領域的研究熱點之一[4-5]。將適配體前沿學術知識理論和實驗融入分析化學理論教學和實驗教學中，有助于推動分析化學教學與國家需求相銜接[1,6]。

本文聚焦分析化學的實驗教學改革，設計了實驗“核酸適配體熒光分子開關測定茶葉中的啶蟲脒”。適配體熒光分子開關是適配體熒光傳感器最常見的策略，屬于無需基底的靶分子非標記模式(即SFALF模式)[7]。此模式下無需將適配體固定在基底上，整個傳感過程在均相溶液中完成。傳感信號主要來自適配體-靶分子結合過程對體系產生的擾動。不僅操作簡單，即使動手能力薄弱的學生依然可以輕松駕馭；而且設計靈活，可以激發學生自主探索的興趣，有助于創新能力的培養。在靶標分析物的選擇上，關注到近年來越顯突出的茶葉中的農藥殘留問題，特別是新煙堿類農藥(如啶蟲脒、吡蟲啉等)超標現象時有發生[8]，不僅成為人體健康不可忽視的隱患，而且對茶葉行業造成巨大的經濟損失。因此，本實驗以啶蟲脒為靶分子，設計適配體熒光分子開關，建立茶葉中啶蟲脒定量分析方法，加快我國茶葉行業的轉型和升級，保障消費者的健康。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

啶蟲脒特異性結合適配體(即ABA)的序列來源于文獻[9]。實驗所用核酸鏈均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如表1所示。啶蟲脒購自Sigma公司，Tris-鹽酸緩沖液(1 mol/L，pH7.6)購自阿拉丁試劑公司。實驗用水均為Millipore超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。熒光光譜用Fluoromax-4型熒光光譜儀(法國Horiba Jobin Yvon)測定。

表1 實驗中使用的核酸鏈

1.2 BHQ1-cDNA對FAM-ABA的光淬滅效應測量

取8個干凈的5 mL容量瓶，分別加入500 μL濃度為0.1 μmol/L的FAM-ABA，0、50、200、300、400、500、1 000、2 000 μL濃度為0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，再用Tris-鹽酸緩沖液定容至5 mL。然后，置于37 °C下反應1 h。最后，以480 nm為激發波長測量系列溶液的熒光光譜。

1.3 啶蟲脒的標準曲線

取9個干凈的5 mL容量瓶，分別加入500 μL濃度為0.1 μmol/L的FAM-ABA和500 μL濃度為0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，37 °C下反應1 h。再向其中分別加入500 μL不同濃度(0，0.025，0.25，0.5，2.5，5 mg/mL)的啶蟲脒溶液(丙酮為溶劑)，并用Tris-鹽酸緩沖液定容至5 mL，37 °C下反應1 h。最后，以480 nm為激發波長測量系列溶液的熒光光譜。以發射波長520 nm處的熒光強度為縱坐標，啶蟲脒濃度的對數值為橫坐標，繪制啶蟲脒的標準曲線。

1.4 茶葉中啶蟲脒的檢測

在啶蟲脒測定前，首先根據文獻[10]進行了樣品制備，具體操作步驟如下。取5 g茶葉放進100 mL沸水中煮4 min，待冷卻至室溫后，過濾掉茶葉。再將濾液用0.22 μm濾膜過濾器過濾3次，收集清液。取1個干凈的5 mL容量瓶，加入500 μL濃度為50 mg/mL的啶蟲脒溶液，并用茶葉清液定容至5 mL，獲得檢測樣品。

然后，再取1個干凈的5 mL容量瓶，加入500 μL濃度為0.1 μmol/L的FAM-ABA和500 μL濃度為0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，37 °C下反應1 h。再向其中加入500 μL檢測樣品溶液，并用Tris-鹽酸緩沖液定容至5 mL，37 °C下反應1 h后，以480 nm為激發波長測量溶液的熒光光譜。取發射波長520 nm處的熒光強度，代入標準曲線，計算樣品中的啶蟲脒含量。最后，用測定的啶蟲脒含量值除以理論值，計算回收率[11]。

2 結果與分析

2.1 熒光分子開關設計

本實驗以“雙鏈-復合物法”構建適配體熒光分子開關[12-13]，其原理如圖1所示。將熒光基團FAM標記在啶蟲脒適配體ABA的5′端，形成FAM-ABA。將淬滅基團BHQ1標記在適配體互補鏈cDNA的3′端，形成BHQ1-cDNA。當FAM-ABA與BHQ1-cDNA雜交成雙鏈時，FAM和BHQ1位于雙鏈同一端，彼此靠近。在波長為480 nm的激發光照射下，FAM發射的熒光以非輻射形式轉移至BHQ1，即發生熒光共振能量轉移(FRET)現象。在熒光光譜上可觀察到，FAM-ABA的熒光強度比它單獨存在時要低得多，即熒光發生淬滅。若樣品中存在靶分子啶蟲脒，FAM-ABA傾向于與其靶分子結合，而使雙鏈解離，FAM和BHQ1彼此遠離。研究表明，FRET效率與熒光基團-淬滅基團間距離的6次方成反比[14-15]。因此，當啶蟲脒存在時，FRET效應減弱甚至消失，FAM-ABA的熒光部分或完全恢復。由此可見，FAM-ABA與BHQ1-cDNA構成的雙鏈結構，因啶蟲脒的存在與否，形成熒光信號的關和開。以此構建的適配體熒光分子開關可用于啶蟲脒的測定。

圖1 適配體熒光分子開關的工作原理

2.2 BHQ1-cDNA對FAM-ABA的熒光淬滅效應

為了驗證BHQ1-cDNA對FAM-ABA的熒光淬滅效應，將FAM-ABA(10 nmol/L)先與不同濃度的BHQ1-cDNA雜交后，測量系列溶液的熒光光譜。如圖2所示，在420 nm激發波長下，FAM-ABA在520 nm處形成一熒光發射峰。隨著BHQ1-cDNA濃度從0逐漸增加到40 nmol/L，520 nm處熒光峰的強度逐漸降低。這說明FAM-ABA與BHQ1-cDNA雜交后，熒光發生淬滅，FRET現象發生。并且，觀察到當BHQ1-cDNA濃度為10 nmol/L(即與FAM-ABA濃度相同)時，已有58%的熒光發生淬滅，可以用于啶蟲脒測定。

圖2 FAM-ABA(10 nmol/L)與不同濃度BHQ1-cDNA作用后，在480 nm激發波長下的熒光光譜

2.3 啶蟲脒的標準曲線

為了獲得啶蟲脒的標準曲線，首先對啶蟲脒對雜交雙鏈體系的熒光強度影響進行了探究。將FAM-ABA(10 nmol/L)先與BHQ1-cDNA(10 nmol/L)雜交成雙鏈后，再與濃度分別為0，2.5，25，50，250，和500 μg/mL的啶蟲脒反應，最后，測量系列溶液的熒光光譜。如圖3所示，隨著BHQ1-cDNA濃度從0逐漸增加到500 μg/mL，520 nm處熒光峰的強度逐漸增高。這說明，FRET效應減弱，啶蟲脒的存在可以引起FAM-ABA與BHQ1-cDNA的分離。另外，還可以注意到，即使使用500 μg/mL(相當于2.25 mmol/L，遠高于核酸的使用濃度10 nmol/L)啶蟲脒，依然不能使FAM-ABA的熒光強度完全恢復，推測機理可能同時存在內濾效應[16]。

圖3 FAM-ABA及不同濃度啶蟲脒作用下雜交雙鏈體系的熒光光譜

然后，取520 nm處熒光強度為縱坐標，啶蟲脒濃度的對數值為橫坐標，繪制啶蟲脒的標準曲線。如圖4所示，當啶蟲脒濃度在2.5～500 μg/mL時，熒光強度與啶蟲脒濃度的對數值呈良好線性相關性。

圖4 熒光分子開關測定啶蟲脒的標準曲線

2.4 茶葉中啶蟲脒檢測

按照前述實驗操作步驟制備含有啶蟲脒的茶葉樣品溶液，與雜交雙鏈體系作用后，測定體系熒光光譜。取520 nm處的熒光強度，代入標準曲線，計算樣品中的啶蟲脒含量為50.46 μg/mL，與理論值接近，回收率計算得100.92%，說明該方法準確可靠，可用于實際樣品檢測。

3 實驗特點

本實驗是科研成果反哺基礎實驗教學的典型案例，具有以下突出特點。

(1) 強調科技前沿與實際問題的結合，增強學生服務國家社會的意識。本實驗立足食品安全國家重大戰略，聚焦茶葉農藥殘留超標實際問題，突破傳統儀器分析在實際應用中的局限，以茶葉常用農藥啶蟲脒為靶分子，結合適配體傳感檢測前沿技術，設計適配體熒光分子開關，建立新型檢測方法。本實驗始于實際問題，止于實際應用，有助于提高學生利用所學解決實際問題的能力，增強服務社會、熱愛國家的情操和意識。

(2) 匹配學生實操基礎，助力學生把握科技前沿。本實驗所需關鍵材料為FAM-ABA和BHQ1-cDNA兩條核酸鏈，屬于商業化定制材料，極易獲得。整個實驗過程，除了簡單的溶液配制外，不涉及任何工藝復雜的材料制備，非常便于操作，能夠與學生薄弱的實操基礎相匹配。在實驗技能上不設置門檻，重在培養解決問題的能力，以及把握科技前沿的能力。

(3) 強化科研思維，培育創新源動力。本實驗流程包括：①熒光分子開關設計；②BHQ1-cDNA對FAM-ABA的熒光淬滅效應；③啶蟲脒的標準曲線；④茶葉中啶蟲脒的檢測。其中，第①步是原理設計，“提出假設”；第②、③步是原理可行性驗證，“小心求證”；第④步是應用拓展。這種根據問題構建科學假說、根據假說設計實驗合理求證、根據實驗結果再調整甚至重構科學假說的教學設計，是科研思維的具體表現，有助于培養學生創新意識。在假設階段，啟迪學生不迷信學術權威，不盲從既有學說，敢于大膽質疑。在求證階段，要求學生嚴格求證，唯真唯實。在應用階段，引導學生融入實際應用情景，以解決實際問題為己任。

4 結 語

本實驗將分析化學學科研究熱點—適配體熒光分子開關引入本科實驗教學，面向國家重大需求，科研思維貫穿教學始終。通過本實驗，學生們不僅可以接觸到學科前沿，更重要的，在解決實際問題的過程中，科研思維得以塑造，科學視野得以拓展，愛國意識得以加強，創新精神得以喚醒。本實驗將推動分析化學突破經典的束縛，與前沿接軌，與國家社會需求緊密銜接。