熒光分析實驗的教學拓展與探索

賈 莉, 馬鍇果, 趙 浩, 耿金靈, 朱志偉

(北京大學 化學與分子工程學院，化學國家級實驗教學示范中心，北京 100871)

0 引 言

熒光分析技術在基礎研究和應用領域具有極大的應用，其教學實驗涉及內容廣泛。眾多高校對熒光分析法實驗進行了改進和實驗內容更新，結合新技術、新材料，以體現近期的科研進展和研究熱點，開拓學生視野，培養和提高學生的綜合能力[1-2]。但此類實驗面向低年級學生開設，由于學生理論知識欠缺，高度集成化的熒光光度計其重要部件被封閉在黑盒子里，學生在理解熒光光譜法基本概念、光度計結構及工作原理方面存在很多困惑，實驗過程基本停留在溶液配制、電腦程序操作和數據記錄水平上，實驗積極性不高，教學效果不理想。這促使中心不得不重新考慮實驗項目的設計。經典實驗在培養學生掌握基礎知識、基本操作技能、實驗方法以及學生的科學思維和科學態度方面具有舉足輕重的地位，而且也符合學生的認知規律[3-4]。因此，在傳承經典實驗項目的基礎上，對傳統的熒光分析法實驗教學模式進行創新，使其更好地面向低年級學生開設具有十分重要的意義[5-6]。

近年來，學生自己動手組裝實驗儀器并進行儀器應用拓展的教學模式，在提高學生實驗興趣、培養創新能力方面發揮了極其重要的作用[7-10]。目前，這種教學模式在國內的熒光分析法實驗教學中還未見相關報道。為此，實驗通過利用發光二極管(LED)及樂高積木搭建簡易熒光光度計，并應用于硫酸奎寧的定量測定。通過有效的實驗教學組織形式，將此實驗模塊引入到常規實驗教學，與經典的熒光分析法實驗項目“飲料中硫酸奎寧的定量測定”內容相結合，利用其趣味性來拓展常規實驗的教學內容。這種教學模式增加了學生的實驗興趣，促進了學生理論與實踐的融會貫通。

1 儀器與試劑

儀器。樂高積木、萬用表(UT61B)、面包板(SYB-130)、發光二極管(LED，355 nm)、Si-PIN光電二極管(400～1 100 nm，LSSPD-1.2，LSSPD-2.5，LSSPD-3.2，LSSPD-4.2)、電源模塊(2.8～5.5 V轉 ±12 V)、運算放大器(OP07CP)、面包板連接線、容量瓶(25 mL)、分度吸量管。

試劑。奎寧儲備液(100.0 μg/mL)，避光保存。使用時，以0.05 mol/L H2SO4溶液稀釋成10.0 μg/mL的工作液。

2 自制熒光光度計的設計和搭建

2.1 儀器設計思路

利用LED及樂高積木搭建的光度計，結構簡單，易于實現，非常適合引入常規實驗教學[11-15]。現已報道的自制LED熒光光度計采用LED為檢測器，對光路的準值性要求很高；以內阻較大的伏特表為信號采集工具，實驗成本高；簡易的電路連接方式，測得的光電壓值較低，學生不易獲得測試數據[13]。這些缺點限制其在實際實驗教學中應用。因此，根據實際教學需求，對搭建熒光光度計所需部件及電路連接方式進行了改進和優化，使學生能夠及時準確地獲得測量數據，儀器的精密度和重復性滿足儀器分析實驗教學需求的原則，將其引入熒光分析法實驗教學中。

硫酸奎寧的最大激發波長為350 nm，選擇355 nm的LED燈珠作為單色光源，取代商用熒光光度計中的光柵。檢測器的選擇是光度計性能優劣關鍵。基于硅光電二極管在測量光信號時具有響應快、線性好、靈敏度高、噪音小、性能穩定的優點[16]，故搭建儀器時以硅光電二極管作為檢測器。根據硫酸奎寧的最大發射為450 nm，可選擇400～1 100 nm的Si-PIN光電二極管來實現光電檢測功能。萬用表作為信號采集工具，其在精密度、可靠性方面具有良好性能，且降低了實驗成本。在電路連接方面，采用放大電路可有效克服因光電壓值較低而不易獲得測試數據缺點[15]。

2.2 儀器搭建

儀器搭建時，將LED燈珠和Si-PIN光電二極管分別塞入已打好孔的樂高，并在背面用醫用膠帶固定，使兩者高度一致且處于垂直位置，再將四面透光的石英比色皿的底部用醫用膠帶固定在下層樂高上。自制熒光光度計實物連接圖(見圖1)，詳細電路連接方式見文獻[15]，其中Si-PIN光電二極管可以選擇不同的光敏面直徑。測定時，檢測器所測得的熒光強度與光電壓成正比。為避免外界光對測試結果的影響，應將比色皿四周用樂高進行避光。

圖1 自制熒光光度計實物圖

3 自制熒光光度計用于硫酸奎寧定量測定的性能探究

3.1 實驗內容

(1) 線性范圍的確定。向一系列25 mL容量瓶中加入不同體積的奎寧儲備液或工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，配制一系列濃度為0.10～100.0 μg/mL的奎寧標準溶液。利用自制熒光光度計分別測試系列奎寧標準溶液的光電壓值。以測量得到的光電壓V(mV)為熒光強度對奎寧的濃度c(μg/mL)進行線性回歸，確定硫酸奎寧在什么濃度范圍內與熒光強度呈良好的線性關系。

(2) 標準曲線的繪制。向25 mL容量瓶中分別準確加入0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL的10.0 μg/mL奎寧工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，分別利用自制熒光光度計依次測量溶液熒光產生的光電壓，擬合線性回歸方程，計算相關系數。

(3) 檢測限的測定與計算。以0.05 mol/L H2SO4溶液為空白樣品分別測定10次，所產生的光電壓值按照式①計算自制熒光光度計的檢測限[17]。

Ck=3s/k

(1)

式中：Ck為方法檢測限；s為空白標準偏差；k為校準曲線斜率。

(4) 重復性和準確度測定。向25 mL容量瓶中用吸量管準確移取0.75 mL的10.0 μg/mL奎寧工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，搖勻，作為待測溶液。利用自制熒光光度計對未知液連續測定6次，計算測定值的相對標準偏差和相對誤差。

3.2 數據與分析

(1) 線性范圍的確定。不同濃度硫酸奎寧標準溶液的測定結果如圖2所示，從測試結果可以看出熒光強度隨硫酸奎寧濃度的增大而增加，當硫酸奎寧標準溶液濃度在0～10.0 μg/mL范圍內時與熒光強度呈線性關系。隨硫酸奎寧溶液濃度的增大，由于自淬滅使熒光強度與濃度偏離線性關系。

圖2 不同型號檢測器測定硫酸奎寧標準溶液的光電壓-濃度線性關系

(2) 線性回歸分析及檢測限。利用自制熒光光度計分別測定不同濃度的硫酸奎寧標準溶液的熒光光電壓，并繪制光電壓標準曲線。以奎寧濃度c為橫坐標，測定的光電壓V為縱坐標作圖，得到的標準曲線分別如圖3所示。從測定結果可以看出，在測試的濃度范圍內，所測得的光電壓與奎寧濃度都有著良好的線性關系，表明自制熒光光度計可用來定量測定硫酸奎寧濃度。

(a) LSSPD-1.2型檢測器>

按照式(1)的方法計算可得到4種熒光光度計的檢測限，見表1。結果顯示，相較于光敏面直徑為1.2 mm的LSSPD-1.2 型Si-PIN光電二極管，其他3種光敏面積更大的檢測器所搭建的熒光光度計的檢測限更低且數值相當。

表1 標準偏差(SD)和檢測限(LOD)

(3) 重復性和準確度。未知液中硫酸奎寧的實際濃度為0.30 μg/mL，利用不同型號檢測器測定未知液的6次測定結果見表2。根據測定未知液濃度的標準偏差可知，測試結果的重復性可以滿足教學需求，并且自制熒光光度計測試結果的相對誤差均在5%以內，說明測定結果是準確、可靠，滿足儀器分析實驗的基本要求。

表2 方法重復性和準確度測定結果(單位mg/L)

3.3 性能分析

通過對LED樂高型簡易熒光光度計進行改進和完善，將其運用于硫酸奎寧的定量測定，評價使用不同Si-PIN檢測器的測定效果，考察了方法的線性范圍和儀器的檢測限、重復性及準確度。實驗結果表明：熒光光度計的搭建過程簡單，學生更易及時準確地獲得測試結果。且4種不同型號檢測器所搭建的儀器性能均能滿足儀器分析實驗教學需求，可較好地實現硫酸奎寧的定量測定，適合引入到實際教學。

4 教學模式

將熒光光度計搭建及定量測定硫酸奎寧性能探究的實驗模塊與常規實驗項目“飲料中硫酸奎寧含量的測定”實驗內容相結合。實驗為8學時，學生2人1組，合作完成。實驗過程中，注重教師的引導作用，開展不同層次的實驗教學。

4.1 注重教師引導，逐步培養學生的探究實踐能力

在實際教學過程中，學生在完成常規實驗內容的基礎上，從儀器的搭建到應用，全過程參與此實驗模塊。通過常規實驗內容的訓練，學生掌握了如何利用熒光光度計進行定量測定，儀器的哪些性能會影響測試結果，儀器的使用需要注意哪些問題等。學生掌握了相關的基本實驗技能之后，再利用基本的電器元件搭建簡易熒光光度計，加深學生對儀器結構及工作原理的認識。以探究型實驗教學模式開展自制儀器進行硫酸奎寧定量測定的性能評價的實驗內容，指導教師通過和學生一起對得到的實驗數據進行分析，討論這些數據能夠說明哪些問題，可以得到什么樣的結論，要得到這樣的結論還需要什么樣的實驗來支持和驗證等。在這個過程中，逐步培養學生分析判斷、邏輯推理、根據實驗結果得出實驗結論的能力。

4.2 以學生為主，為學生提供充分發揮創造力和想象力的空間

基于自制熒光光度計具有很強的靈活性和直觀性，在課時允許的條件下，對那些學有余力，且熱情參與探究性實驗的同學，可通過以下四個方面來豐富和拓展該自制儀器的應用[13]。

(1) 自制熒光光度計有很強的開放性，通過改變LED光源和檢測器數量，如圖4所示，測定相應的熒光強度，探索熒光強度對儀器靈敏度的影響。

(2) 溫度對熒光強度的影響較為靈敏，通過分別測定室溫及冰水浴冷卻后的奎寧標準溶液的熒光強度，探索溫度對熒光強度的影響。

(3) 熒光淬滅的形式有很多，利用自制熒光光度計可以很直觀地觀察到不同形式的熒光淬滅現象，如：觀察低、中、高濃度奎寧溶液熒光的自淬滅現象，向奎寧溶液中加入不同濃度的NaCl溶液可以觀察到由于發生電荷轉移反應而產生的熒光淬滅現象等。

(4) 在光源照射下，向盛有硫酸奎寧的比色皿中加入液氮，可觀察到明顯的磷光現象。

(a)

5 教學效果

自制熒光光度計是教師針對教學的重點和需求，對已報道的儀器進行改進和完善的成果。學生設計的自制熒光光度計實驗具有可設計性、內容靈活性和多樣性，非常適合應用于熒光分析法實驗教學。經過1年的教學實踐，學生普遍反映通過搭建儀器，有助于更深刻地理解熒光光度計的結構及工作原理；通過儀器性能探究，有助于將理論與實踐融會貫通，激發學習興趣，培養開發探索能力；同時，實驗的開展形式給予了學生極大的自由度和空間，有助于自主且創造性地完成實驗并加以拓展。將自制儀器及應用拓展與常規實驗相結合的教學模式，是對知識的學習、運用和鞏固，也是對傳統經典實驗教學模式的突破和創新，使之更加適應新的實驗教學發展趨勢，更加豐富其內涵。同時教師在設計和制作過程中也提高了自身專業水平，進而促進了教學質量的提升。