運用流式細胞術推進自主研究型免疫學實驗改革的探討

竇 環， 喬曉月， 傅娟華， 王婷婷， 侯亞義， 沈蘇南

(南京大學 a.醫學院； b.生命科學學院， 南京 210023)

0 引 言

拔尖創新能力的培養有助于新醫科人才成功面對未來醫學的挑戰，提高我國在醫學科學領域的核心競爭力。免疫學作為基礎醫學的前沿學科，在臨床醫學、重大疾病的預防與治療、生物制藥等領域發揮了越來越重要的作用。自主研究型教學將有利于免疫學實驗教學發揮其對于新醫學專業人才綜合能力和創新能力培養的關鍵性作用。我校醫學院免疫學教研室在推進自主研究型免疫學實驗教學改革的過程中，圍繞總體教學目標，在夯實免疫學基本理論和基本實驗方法的基礎上，引導學生發現未知答案的新問題，學生在強烈學習動機的支配下，制定明確的研究目標和研究計劃，采用前沿性的免疫學檢測分析方法，創新性地完成實驗過程。學生在完成此類型實驗的過程中，大大提升了免疫學研究的科學素養，而不僅僅滿足于知識點的學習。

一般認為，在腫瘤、慢性炎癥、創傷等病理狀態下，固有免疫系統出現了一群未成熟的髓系細胞：髓源抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，包括髓系祖細胞、不成熟的巨噬細胞、不成熟的粒細胞以及不成熟的樹突狀細胞等[1]。通常，MDSCs 細胞主要分為兩大類：粒細胞樣 MDSC(granulocytic MDSC，G-MDSC)和單核細胞樣 MDSC(monocytic MDSC，M-MDSC)；G-MDSC 在表型和形態上與中性粒細胞相似，而 M-MDSC 與單核細胞更相似，并且利用不同的功能分子抑制免疫反應。在多種腫瘤患者的組織中，MDSCs 明顯增加且可通過直接或間接方式抑制 T 細胞的免疫活性，進而介導腫瘤的免疫逃逸[2]。近年研究顯示，MDSCs 及其亞群具有一些新的生物學功能：MDSCs可作為破骨細胞祖細胞，在骨髓微環境的 IL-6、IL-11 和 RANKL 細胞因子作用下向成骨細胞分化；在腫瘤微環境內，M-MDSC 可直接破壞腫瘤相關抗原特異的 T 細胞活化反應；臨床肝衰竭病人體內發現，M-MDSC 具有較弱的細菌吞噬能力等。在以往的免疫學實驗教學過程中，上述學科進展僅停留在知識點層面，對MDSCs的免疫學特性無法通過實驗操作進行深入學習。

我院免疫學教研室嘗試推進自主研究型免疫學實驗教學，如何有效地開展相關實驗教學一直是工作的重點。近期，同學們分別對兩批周齡相同的雌性C57BL/6小鼠進行側腦室生理鹽水注射手術，發現除了一批小鼠術后恢復良好外，另一批小鼠出現了明顯的神經損傷現象，具體表現為：小鼠身體呈屈曲狀，有向左側或右側傾斜、旋轉以及連續轉圈的行為，甚至引發小鼠死亡。指導教師立即引導同學們分析原因，復盤實驗過程，同學們推測這可能與實驗動物銷售公司在出售前，分別給兩批小鼠喂食了維持飼料和繁育飼料這兩種不同的飼料有關。基于此次教學實踐中的偶然發現，在病原體鑒定與免疫細胞分析技術教學中，以學生為中心，突出流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)這一抓手，開展了“繁殖飼料對腦室注射小鼠髓系細胞免疫功能影響評價”的探索，詳細分析腦室注射小鼠MDSCs及其亞群的比例與功能在維持飼料飲食組和繁殖飼料飲食組之間的差異。本文以此教學實踐為例，對自主研究型實驗教改經驗進行了總結，以期為培養拔尖創新型新醫科人才做好準備。

1 實驗動物及飼料

無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)級雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供[SCXK(蘇)2016-0010]，飼養于SPF級屏障系統中，室溫22～24 ℃，室內相對濕度40%～70%，保持室內12 h進行燈的明暗自動切換，小鼠可以自由進行水和食物的攝取。維持飼料及繁殖飼料均委托江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司制作。

2 實驗試劑及儀器

紅細胞裂解液、Fc受體阻斷劑(Miltenyi Biotec，貨號：130-092-575)、抗鼠CD45-APC(Biolegend，貨號：103112)、抗鼠CD11b-FITC(BD Pharmingen，貨號：553310)、抗鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)-Alexa Flour 647(Biolegend，貨號：108418)、抗鼠Ly6c-PE(Biolegend，貨號：128008)、抗鼠CD3-Alexa Flour 532(Miltenyi Biotec，貨號：130-109-836)、抗鼠CD4-PE Cy5.5(Biolegend，貨號：100410)、抗鼠CD8-APC Cy7(Biolegend，貨號：100714)均購自南京福麥斯生物技術有限公司。

GentleMACS全自動組織處理器(Miltenyi Biotec)、全光譜流式細胞儀(Cytek)由南京大學醫學院基礎醫學教學中心提供。

3 實驗步驟

基于教學實踐中的偶然發現，結合本實驗目的——掌握流式細胞術原理及方法，引導學生自主查閱文獻，經課堂討論與任課教師商議后，最終擬定具體步驟。實驗流程見圖1。

圖1 繁殖飼料對腦室注射小鼠MDSCs免疫功能影響評價實驗流程

4 FCM檢測方法的建立

4.1 單細胞懸液的制備

以脾臟細胞為例，獲取小鼠脾臟組織，取大小約1/4組織塊放入GentleMACS分離管C管中，加PBS 5 mL，選擇小鼠脾臟裂解程序，研磨組織塊2次；組織勻漿以濾網過濾去除殘渣，收集至離心管中，再用PBS沖洗C管，殘液經過濾網收集至離心管中，4 ℃，300 g離心5 min，棄上清；加入1 mL 紅細胞裂解液重懸細胞，室溫下裂解紅細胞1 min，5 mL PBS終止裂解，4 ℃，300 g離心5 min，棄上清；1 mL PBS洗兩次，調整細胞密度為1×106/mL，備用。

4.2 流式抗體染色

將制備好單細胞懸液分裝各流式管中(每管不少于1×106個細胞)，于各樣品管中加入FC-blocker稀釋液，室溫下封閉10 min；加入10 μL流式抗體稀釋液混勻，注意做好陰性對照、同型抗體對照、單標抗體對照、FMO對照等處理，4 ℃避光孵育30 min，500 μL PBS洗滌兩次，加100 μL PBS混勻，進行流式檢測。

4.3 流式細胞術圈門策略

以小鼠外周血MDSCs的圈門策略為例，學生們通過參考相關文獻[3-4]，先依據FSC-A/SSC-A散點圖排除細胞碎片并圈出細胞(一級門)，然后在SSC-H/SSC-A散點圖中去除粘連細胞(二級門)并圈出單個細胞，接著在CD11b-FITC/Gr-1-AF647細胞群散點圖中選定 CD11b+Gr-1+細胞群為 MDSCs(三級門)，在CD11b-FITC/SSC-A細胞群散點圖中選定CD11b+細胞群(三級門)，最后在Gr-1-AF647/Ly6c-PE細胞群散點圖中選定CD11b+Gr-1+Ly6Clo細胞群為G-MDSC(四級門)、選定CD11b+Gr-1-Ly6Chi細胞群為M-MDSC(四級門)，詳見圖2。

圖2 流式細胞儀分析MDSCs的圈門策略

5 實驗結果與分析

5.1 繁殖飼料對腦室注射小鼠MDSCs及其亞群細胞比例的影響

通過FCM技術檢測各組小鼠骨髓樣本后，學生們發現：術后第1天，與維持飼料組相比，繁殖飼料組骨髓中總的MDSCs比例無明顯變化，G-MDSCs細胞比例減少，M-MDSCs比例增多；術后3或5天，繁殖飼料組小鼠骨髓總的MDSCs比例與G-MDSCS變化一致，均表現為增加，而M-MDSCs比例減少[見圖3(a)]。小鼠脾臟樣本結果顯示：與維持飼料組相比，繁殖飼料組小鼠在術后1～5天內，脾臟總MDSCs和G-MDSCs的比例一直呈現明顯增加現象，而M-MDSCs的比例出現相反的變化趨勢[見圖3(b)]。

5.2 繁殖飼料對腦室注射小鼠外周T細胞及其亞群比例的影響

學生通過查閱文獻，了解到MDSCs常在晚期癌癥患者體內出現[5-6]，被認為是先天性和適應性免疫的有效抑制劑，可以抑制CD4+和CD8+T細胞的活化[7-8]。因此，指導老師建議學生繼續分析兩組小鼠的T細胞及其亞群細胞比例。通過FCM技術檢測各組小鼠外周血樣本，學生還發現：與維持飼料組相比，術后1～3天，小鼠外周血的CD3+總T細胞、CD4+以及CD8+T細胞比例均無明顯改變；術后5天，CD3+T細胞比例仍無明顯變化，但CD4+T細胞比例顯著減少，CD8+T細胞比例明顯增加[見圖4(a)]。小鼠脾臟的結果也顯示：與維持飼料組相比，術后1～5天，小鼠脾臟CD3+總T細胞、CD4+和CD8+T細胞的比例均明細增加[見圖4(b)]。結合MDSCs及其亞型比例的變化，因此，可以推測，在不同飼料條件下，M-MDSCs可能產生抑制T細胞的作用。

圖4 小鼠外周血和脾臟內T淋巴細胞的變化

5.3 繁殖飼料對腦室注射小鼠腦免疫細胞的影響

炎癥介質會損害未成熟的骨髓細胞通過MDSCs向巨噬細胞、粒細胞或樹突狀細胞的分化。當炎癥發生時，位于骨髓和外周淋巴器官中的MDSCs通過趨化性遷移到發炎的組織中，發揮其免疫抑制功能，預防組織損傷，但同時也干擾組織中免疫穩態的維持，例如抑制小膠質細胞和效應T細胞的功能[9]。因此，在上述實驗探索的基礎上，指導教師建議學生也繼續對腦中免疫細胞改變進行分析。通過FCM技術檢測，學生發現：與維持飼料組相比，術后1～5天內，繁殖飼料組小鼠海馬和皮層中的小膠質細胞比例持續減少，浸潤的巨噬細胞比例持續增加；但是，淋巴細胞先術后在第1～3天內減少、第5天時增加(見圖5)。

6 討論與總結

病原體鑒定與免疫細胞分析技術實驗課程是我院免疫學學科體系中重要的組成部分，主要介紹了醫學微生物、寄生蟲等病原體的基本特征及分離鑒定方法、各類免疫細胞基本功能以及臨床上常用的免疫檢測技術。通過基礎型、綜合型實驗教學的努力，實現了臨床醫學專業學生在病原微生物和免疫學理論知識上的拓展和實踐[10-12]。因此，在培養高層次醫學拔尖創新人才目標指導下，如何對該實驗課程進行教學改革，這是免疫學教研室一直以來關注的焦點。自主研究型實驗，不僅可以加深學生對理論知識的理解，而且通過自主設計實驗、實施相關操作，更加有助于提高他們動手操作、獨立思考和靈活調用理論知識來發現問題、分析問題并解決問題的綜合能力。高校實驗教學同行們也在根據自身教學資源以及施教學生的素質情況，進行不斷教學探索和創新。劉亞豐等將虛擬仿真技術運用于生物技術自主研究型實驗，彌補生物大分子分離純化實驗教學中的不足[13]。吾爾恩·阿合別爾迪等利用新疆伊犁河谷特色微生物資源，融入微生物學研究型實驗教學改革，取得了積極的教學效果[14]。FCM是一種綜合了激光技術、電子物理、光電測量、流體力學、計算機技術以及細胞熒光化學、單克隆抗體等各學科的知識為一體的新型分析技術[15]。以流式細胞術為抓手開展的自主研究型實驗，能夠幫助學生掌握FCM的基本原理及應用領域，培養流式細胞儀獨立操作技能，與免疫學研究的前沿進展相結合，促成了學生創新和科研實踐能力的提高。

基于免疫學實驗教學中的偶然發現，嘗試以流式細胞術為抓手開展自主研究型實驗教學，引導學生根據實驗目的自主查閱文獻、總結實驗方案，經過課堂討論環節擬定具體流式細胞術實驗方案，以學生為主體實施實驗檢測過程，最終學生們通過詳細分析小鼠MDSCs及其亞群、T細胞以及腦內免疫細胞的比例，評價了腦室注射小鼠在維持飼料組和繁殖飼料組之間的MDSCs細胞的免疫功能差異，這極大地提高了學生學習的自主性和實踐性。同學們通過自主研究型免疫學實驗教學的實踐，初步發現小鼠6～8周前喂食繁育飼料和維持飼料等兩種不同的飼料，將對腦室注射手術的小鼠產生影響，如外周血、脾臟、骨髓甚至腦中主要免疫細胞的比例以及免疫功能出現顯著差異，提示實驗前及實驗過程中需要確保實驗小鼠喂食正確，否則會對實驗結果造成不良影響。此外，本教學實踐還存在不足，對于造成維持飼料組和繁殖飼料組的腦室注射手術小鼠免疫細胞數量產生差異的原因尚不能最終確認，還有待進一步探究。學生還通過分析飼料營養成分，發現這兩種飼料的差別主要在于繁殖飼料中賴氨酸、蛋氨酸和胱氨酸的含量高于維持飼料，接著他們通過查閱氨基酸代謝與抗腫瘤研究領域的文獻，驚喜地發現，恰恰有報道指出胱氨酸能夠抑制MDSCs 的活性，進而減少免疫抑制的發生[16]。然而，在腦室注射小鼠中未有這3種氨基酸與MDSCs相互作用的相關報道。大家一致認為，本實驗教學發現喂養繁殖飼料的腦室注射小鼠骨髓和脾臟中MDSCs數量與正常組相比有顯著變化，可能為氨基酸代謝與MDSCs的相關性研究初步提供依據，也為進一步提高學生科學研究能力解決相關科學問題打好了扎實的理論和實踐的基礎。

綜上所述，在病原體鑒定與免疫細胞分析技術教學中運用流式細胞術推進自主研究型免疫學實驗教學的經歷十分寶貴，為其他醫學院校的相關課程改革提供了一定的參考，也為國家培養拔尖創新型新醫科人才貢獻了力量。