分子對接技術在藥物化學實驗中的教學實踐

席佳越， 張東旭， 聶慧芳， 劉雪英， 李曉曄

(中國人民解放軍空軍軍醫大學 藥物化學與藥物分析學教研室， 西安 710032)

0 引 言

2018年，時任教育部部長陳寶生在教育部高等學校教學指導委員會成立會議上強調：“要把本科教育放在人才培養的核心地位、教育教學的基礎地位、新時代教育發展的前沿地位。要深入學習貫徹全國教育大會精神，全面振興本科教育”。2020年全國教育工作會議上，再次強調，把本科教育抓落實[1]。

抓好本科教育，就應全面改革教學方法、優化課程建設，理論與實踐并行，做到與時俱進。但當下的本科教育，多出現“重理論、輕實踐”的現象，因此，實驗教學成為不可忽視的一環。為了提高我系實驗教學質量，一方面豐富實驗內容，剔除陳舊實驗，增加創新探索實驗，做到學科交叉；另一方面，將科研常用技術引入實驗教學中，去培養學生的科研思維和綜合能力。以藥物化學實驗課為例，藥物化學作為藥學領域橋梁學科，是以無機化學、有機化學為基礎，同時融合細胞生物學等生命學科的綜合性交叉學科，而藥物化學實驗作為理論課的補充與延伸，不光要重視學生合成能力的培養，更應該培養他們樹立藥物設計基于靶點的觀念[2-3]。

計算機輔助藥物設計(Computer Aided Drug Design，CADD)是隨著分子生物學、X射線晶體學的大力發展，計算機科學的迅速崛起而產生的[4-5]。CADD是以計算機化學為基礎，通過計算機模擬、計算和預測小分子與生物大分子間的關系，從而設計和優化先導化合物的方法[6]。運用CADD，美國科研人員開發的新化合物能更好地維持對耐藥HIV突變株的抵抗性[4,7]；運用網絡藥理學和分子對接技術，北京中醫藥大學探究出射麻口服液治療新型冠狀病毒的作用機制[8]。運用計算機輔助藥物設計，可以大大加速新藥研發進程，提高藥物研發的成功率、縮短新藥研發周期和降低成本。如今，隨著這項技術的快速發展和廣泛應用，它已成為藥學、化學、醫學、計算機學等科教人員必備的技能之一。分子對接技術作為藥物設計的核心[4]，是一種模擬生物大分子與配體小分子結合及結合強度的計算，通過分子對接的方式，評價配體小分子與受體的生物活性[9]。鑒于此，本教研室對藥物化學實驗課進行改革，將分子對接技術引入2018級藥學四年制本科生實驗內容中去，通過學習分子對接軟件，模擬藥物與靶點的相互作用，更進一步加強學生對藥物化學理論課的學習與鞏固，全方面提升學生實驗綜合素養。

1 分子對接專題——以環氧化酶(COX)對接為例

1.1 實驗目的

(1) 熟悉Protein databank數據庫的使用；

(2) 掌握CDOCKER對接方法與流程，能分析出蛋白與小分子間的作用力；

(3) 了解COX酶蛋白結構。

1.2 實驗原理

分子對接是藥物設計的重要方法之一，其本質是兩個或多個分子之間的識別過程，涉及分子之間的空間匹配和能量匹配，最終找到最佳的結合模式。

分子對接最初思想起源于Fisher E.的“鎖和鑰匙模型”，該理論認為“鎖”和“鑰匙”相互識別的首要條件是它們在空間形狀上要互相匹配。然而，配體和受體分子之間的識別要比“鎖和鑰匙”模型復雜得多。首先，配體和受體分子的構象是變化的，而不是剛性的。配體和受體在識別過程中會互相適應對方的結構，從而達到更完美的匹配。其次，分子對接不但要滿足空間形狀的匹配，還要滿足能量的匹配，這就衍生出目前常用的“誘導契合”理論[10](見圖1)。

(a) 鎖鑰模型

分子對接常用的方法有3種：剛性對接、半柔性對接和柔性對接(見表1)[11]。常用的軟件有：CDOCKER(Discovery Studio)、GOLD、AutoDock、Glide(Maestro)等。而本實驗采用CDOCKER半柔性對接方法完成對接。

非甾體抗炎藥中涉及到一個重要的靶點就是環氧化酶(COX酶)，COX酶包含COX-1和COX-2，二者在氨基酸系列上有60%的同源性。在結構上，COX-1與COX-2都在通道一側的120位存在一個極性較大、可與藥物分子建立氫鍵結合的精氨酸(Arg)殘基；在通道另一側的523位，COX-1是異亮氨酸(Ile)殘基，COX-2則為纈氨酸(Val)殘基。由于纈氨酸的分子小于異亮氨酸，因而在其旁邊留下一點空隙，稱為側袋，具有某種特殊結構的藥物分子可與之結合。在通道開口處的513位，COX-1為組氨酸，COX-2是柔性更好的精氨酸[12](見圖2)。

圖2 COX-1、COX-2蛋白結構上的差異

以上了解了COX-1/2蛋白結構的差異，正是由于COX-2蛋白側袋的出現，為COX-2選擇性抑制劑的發現提供可能。可以通過分子對接的手段，模擬抑制劑與蛋白間的作用，分析出它們的最佳結合模式及關鍵作用力，發現療效更好、毒副作用更低的COX酶抑制劑。

1.3 實驗內容

使用Discovery Studio 2016軟件中的CDOCKER，分別完成氟比洛芬、塞來昔布同COX-1(PDB：3N8Z)[13]、COX-2(PDB：1CX2)[14]的對接任務，分析其相互作用結合模式。

(1) 實驗流程。分子對接主要運用Discovery Studio軟件中的CDOCKER模塊來完成，包括：蛋白準備、配體小分子準備和分子對接，具體操作流程如圖3所示。

(2) 蛋白活性位點定義。蛋白結合位點的確定對于分子對接結果準確性的影響很大，因為配體分子與受體相互作用過程的模擬主要是參考結合位點的幾何特征進行的。

產生結合位點的方法：① 以原配體的位置為中心產生結合位點；② 參考文獻，以活性口袋周圍的關鍵殘基為中心產生結合位點；③ 根據活性口袋特征探測活性位點。

而在本次對接中，使用第①種方法產生結合位點，以PDB：3 N8Z中氟比洛芬所在區域定義為活性位點。

(3) 對接結果分析。完成分子對接后，要從兩方面去分析結果，① 要看打分函數(scoring function)，負責評估結合親和性以及配體位置擺放的合理性[15]，-CDOCKER Energy，它的絕對值越大越好，但打分值不是判斷結合好壞的唯一標準；② 還應關注每個配體構象在蛋白中的空間位置、取向及同蛋白的相互作用力。

圖3 分子對接實驗操作流程

1.4 實驗結果

COX-1抑制劑氟比洛芬產生的10個構象中，第1個構象打分值最高，并且氟比洛芬中的羧基與Arg120形成鹽橋，與Tyr355形成氫鍵作用力，遠端的芳環與Gly526、Ala527形成范德華力，與Tyr385產生Pi-Pi作用力，使分子穩定存在蛋白中。而它的第2個構象因為羧基位置的改變，喪失了同Arg120和Tyr355的作用力，因此第1構象是最優構象，正是在這樣的構象下，發揮活性來抑制COX酶[見圖4(a)]。

COX-2抑制劑塞來昔布的對接結果[見圖4(b)]。分析可得：塞來昔布中甲苯基位于Phe381、Leu384、Tyr385、Trp387、Phe513和Ser530形成的疏水口袋中；三氟甲基位于Met113、Val116、Val349、Tyr355等形成的口袋中。而塞來昔布具有COX-2選擇性是因為苯磺酰胺基團的存在，它好伸入COX-2蛋白的側袋中，使得磺胺基團中的1個氧原子與Arg513形成氫鍵，另1個氧原子與His90形成氫鍵，而氮原子與Phe518形成氫鍵作用力。

因此，COX-2蛋白側袋的存在，是發現COX-2抑制劑的關鍵所在。

2 教學討論

在以往的藥物化學實驗中，均為基礎性合成實驗，從未涉及到計算機輔助藥物設計的內容，實驗內容較為單一。而首次在實驗教學中引入分子對接，一方面豐富了藥物化學實驗內容，使實驗不單單涉及化合物的合成，還涉及到藥物靶點發現及虛擬驗證，學生能清楚地理解如何通過蛋白結構的不同設計出選擇性抑制劑，從而強化靶點在藥物設計中的重要性；另一方面，分子對接技術是對藥物化學理論課知識體系的延伸，學生能更好地理解藥物發現的全過程，是對學生綜合能力的培養，創新能力的提升。

在本實驗項目中，學生課下查閱文獻了解COX酶及亞型結構特征，觀看教師提前錄制好的對接視頻，對分子對接軟件界面、操作步驟有大體了解，在通過課上操作演示，讓學生掌握分子對接軟件使用，直觀地理解小分子藥物是如何與受體大分子進行識別并發揮作用。

在實驗實施過程中，有以下問題：① 課時受限，學生對計算機輔助藥物設計、相關軟件比較陌生，在剛開始接觸的時候，學得比較吃力；② 在進行演示操作流程時，學生能聽明白，但自行上機完成對接內容時，卻無從下手，不知該如何進行參數設置。因此，在以后的實施中，可提前將計算機輔助藥物設計的基礎內容和軟件內容介紹錄制成微視頻，發放到學習通上，讓學生提前預習。課上，通過實時屏幕共享，學生緊跟每一步操作。課后，開放智慧教室平臺，學生通過預約，進入智慧教室自行完成對接任務，真正做到懂操作、會操作。

3 結 語

分子對接技術的引入作為藥物化學實驗內容改革的首次嘗試，是為了讓學生理解并樹立“結構決定性質，性質決定功能” 的觀念，更是為了讓實驗與科研接軌，通過了解熟悉新技術，激發學生的學習的熱情，為日后的科研工作打下堅實的基礎。教師唯有不斷地學習新知識、新技術，不斷地創新改革，才能真正培養出具有創新意識、團隊意識的高素質藥學人才。