鳶尾素促進高糖環境中兔BMSCs骨向分化的機制

史志蕓，鄒蓉芳，時 權，陳 飛，翟玉潔，黃 陽

近年來，2型糖尿病因患病人數迅速增多，已成為嚴重危害人類生活健康的全球性公共衛生問題。2型糖尿病患者體內的高糖環境可抑制骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化并影響種植體的初期穩定性，進而降低口腔種植手術的成功率。新近有研究發現，鳶尾素能促進高糖環境中BMSCs成骨分化，但是其作用機制目前還不清楚。因自噬是維持干細胞的干性和分化能力所必需的，高糖環境中干細胞活性受抑制，而且鳶尾素能激活自噬。因此，本研究將探討鳶尾素促進高糖環境中BMSCs成骨分化是否是通過激活自噬實現的。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑 新西蘭大白兔BMSCs(解放總醫院骨科研究所惠贈)。鳶尾素(美國Phoenix Pharmaceuticals)；α-MEM培養液(美國Gibco)；葡萄糖(湖北科倫藥業)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO； 美國Sigma)；成骨誘導培養液(賽業生物)；青霉素、鏈霉素(石家莊華北制藥)；Trizol(美國Invitrogen)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(上海碧云天生物)；一抗[P62抗體(貨號：#5114, 美國Cell Signaling Technologies)；LC3B抗體(貨號：Ab192890, 英國Abcam)；β-actin抗體(貨號：BM0627，武漢博士德)]、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆二抗(美國Cell Signaling Technology)；BCA測定試劑盒(南京建成)；PVDF膜(美國Millipore)。

1.2 主要儀器 MCO-15AC型二氧化碳恒溫培養箱(日本三洋)；SW-CJ-1FD型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；5702R型低速離心機、Bio-photometer核酸蛋白測定儀(德國艾本德)；340型酶標儀(英國BDSL)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(北京六一儀器)；流式細胞儀(CytoFLEX，美國Beckman Coulter)；正置熒光顯微鏡(BX-53，日本奧林巴斯)。

1.3 兔BMSCs復蘇、培養 從液氮中取出凍存的兔BMSCs，直接將凍存管浸沒在溫水中，并不斷搖動凍存管使凍存液快速融化。5 ml PBS重懸細胞沉淀，離心(716 g，5 min)后棄上清。最后，將BMSCs接入培養瓶中培養，3 d后首次換培養液并在顯微鏡下觀察細胞形態。

1.4 干性鑒定 0.5%胰蛋白酶消化BMSCs，將其制成單細胞懸液(2×10/ml)備用。在EP管中分別加入異硫氰酸熒光素(fluorescein Isothiocyanate；FITC)標記的抗CD11b、CD45、CD29和CD90抗體，低溫環境中避光孵育30 min后洗脫未結合的抗體，流式細胞儀檢測。

1.5 細胞分組 將兔BMSCs接種于24孔板(6.0×10/孔)，當細胞長滿孔底面積的80 %時，換為成骨誘導液培養并將細胞分為4組：對照組，高糖組(培養液中葡萄糖的濃度為44 mmol/L)，鳶尾素組[高糖(44 mmol/L)+鳶尾素(100 ng/ml)]和氯喹組[高糖(44 mmol/L)+鳶尾素(100 ng/ml)+氯喹(20 μmol/L)]。各組細胞成骨誘導5 d后，進行后續實驗。

1.6 自噬相關蛋白的表達檢測 以β-actin為內參，按照Western blotting常規步驟檢測自噬相關蛋白P62和LC3B的相對表達。步驟如文獻[5]：裂解各組細胞并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各樣本取50 μg蛋白進行凝膠電泳(200 mA, 90 min)，將蛋白轉膜于PVDF膜上。室溫條件下封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜(P62抗體的稀釋比例1∶1000；LC3B抗體的稀釋比例1∶2000；β-actin抗體的稀釋比例1∶200)，再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h，最后用化學發光劑顯影，采用Image J軟件分析膠片灰度值。

1.7 成骨相關基因的轉錄表達檢測 按照qRT-PCR常規步驟檢測成骨相關轉錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、ALP、I型膠原(collagen type I，COL-I)和骨鈣素(osteocalcin, OCN)的相對表達量：提取各組細胞的總RNA并檢測RNA含量，再將RNA反轉錄為cDNA，并按95 ℃預變性3 min，95 ℃變30 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸45 s，擴增35個循環，最后72℃ 延伸15 min的條件進行擴增。成骨相關基因序列見表1。

1.8 ALP活性定量 按照試劑盒說明書行ALP活性定量檢測，方法參照文獻[13]。吸去孔板中的成骨誘導液，PBS緩沖液漂洗，加入30 μl Triton X-100，4℃過夜。然后，每孔加入ALP緩沖液和基質液各50 μl，室溫下孵育0.5 h后加入ALP顯色液100 μl，酶標儀520 nm處檢測OD值。每孔重復測試3次。

2 結 果

2.1 BMSCs形態觀察及干性鑒定 兔BMSCs復蘇后貼壁生長，總體觀察呈旋渦狀，單個細胞在形態上呈長條狀或者紡錘狀(圖1)。干性鑒定結果顯示：兔BMSCs低表達造血干細胞表面標志物： CD11b(4.28%)，CD45(7.41%)；高表達間充質干細胞表面標志物：CD29(99.4%)和CD90(99.6%)。

2.2 自噬相關蛋白的表達 Western blotting結果顯示，與對照組相比，高糖顯著升高P62蛋白的表達，同時明顯降低LC3B-II的表達(均<0.05)。鳶尾素干預能顯著降低P62蛋白的表達，同時明顯升高LC3B-II的表達(均<0.05)。加入自噬抑制劑氯喹后，P62和LC3B-II的蛋白表達量均升高(<0.05，表2)。

2.3 成骨相關基因的轉錄表達 qPCR檢測結果(表3)顯示：與對照組相比，高糖組成骨相關基因Runx2、ALP和COL-I的轉錄表達降低，差異有統計學意義(均<0.05)；鳶尾素組Runx2、ALP和COL-I的表達水平顯著升高(均<0.05)；當加入氯喹后，Runx2和ALP的轉錄水平下調，差異有統計學意義(均<0.05)。

2.4 ALP活性 在成骨誘導5 d后：與對照組相比，高糖組細胞的ALP活性顯著降低[(0.171±0.033)(0.257±0.046)；<0.05]；而鳶尾素組細胞的ALP活性明顯升高[(0.276±0.017)(0.171±0.033)；<0.05]；加入氯喹后，ALP活性明顯下降[(0.182±0.029)(0.276±0.017)；<0.05]。

3 討 論

鳶尾素是運動誘導產生的肌源性細胞因子，具有抗炎和抗分解代謝的作用，鳶尾素也能抑制胰島β細胞和人臍靜脈內皮細胞凋亡。而且，鳶尾素可通過激活自噬緩解壓力誘導的心肌肥大和血管緊張素II誘導的心肌細胞凋亡。而本研究發現鳶尾素通過激活自噬促進高糖環境中BMSCs成骨分化。

BMSCs具有分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等多種細胞的潛能，是防治種植術區骨量不足的重要調控靶點。因此，本研究選擇BMSCs研究自噬在干細胞成骨分化中的作用。自噬是一個吞噬細胞自身蛋白或細胞器并將其包裹到囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解和再利用其包裹的內容物的過程，生物體借此滿足自身代謝或者細胞器更新的需求。自噬作為多種疾病的發生機制再過去幾十年被廣泛研究。本研究發現，在BMSCs成骨分化的過程中，高糖環境降低BMSCs的自噬活性，而鳶尾素干預能重新激活自噬。當采用自噬抑制劑氯喹抑制自噬后，鳶尾素促進高糖環境中BMSCs成骨分化的作用明顯減弱，這至少在某種程度上說明鳶尾素促進高糖環境中BMSCs成骨分化是通過激活自噬實現的。既往的研究與本實驗結果一致，即激活自噬能促進BMSCs成骨分化，而使用巴弗洛霉素A1抑制自噬后導致骨生成減少。而且，自噬激活劑雷帕霉素能抑制骨吸收并促進骨生成。

Runx2是BMSCs在成骨分化的過程中發揮啟動作用的關鍵轉錄因子，本研究的PCR結果顯示，當采用氯喹抑制自噬后，鳶尾素促進高糖環境中BMSCs細胞Runx2轉錄表達的作用明顯減弱。而啟動Runx2的轉錄表達能夠促進BMSCs成骨分化的早期標志物ALP和COL-I的表達。當采用氯喹抑制自噬后，鳶尾素促進高糖環境中BMSCs細胞ALP轉錄表達的作用也明顯減弱，COL-I的轉錄表達亦呈下降的趨勢。與此同時，ALP活性檢測也證實，抑制自噬后，鳶尾素促進高糖環境中BMSCs細胞ALP活性的作用明顯降低。但是，鳶尾素對BMSCs成骨分化標志物OCN的轉錄表達卻無影響。抑制自噬后，OCN的轉錄表達也無明顯改變。造成這種差異的原因可能是基因轉錄表達具有時間效應。因為OCN是在成骨晚期，即骨質沉積階段才高表達的，而本研究進行PCR實驗的時間是在成骨誘導后的第5天。

自噬主要受哺乳動物雷帕霉素受體(mammalian target of rapamycin，mTOR)依賴性和mTOR非依賴性信號通路的調節，AMP依賴的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是細胞內AMP/ATP比例敏感性的能量感受器，AMPK激活后可直接抑制mTOR，進而激活自噬。Sirt1是細胞內NAD依賴性的能量感受器，可以調節細胞的能量代謝和細胞生存，也可以通過使幾種自噬相關蛋白和轉錄因子去乙酰化來調節自噬。本研究僅表明鳶尾素通過激活自噬促進高糖環境中BMSCs成骨分化，但對鳶尾素干預激活自噬的信號途徑未進行探討。因此，后續實驗需進一步明確鳶尾素激活自噬的信號轉導途徑。

綜上所述，本實驗發現鳶尾素在體外促進高糖環境中BMSCs成骨分化是通過激活自噬實現的，而這對于加深認識鳶尾素的作用機制具有重要意義。