基于多維拉曼光譜的乳粉表征及判別分析

顧 穎，趙姝彤，熊藍萍，季 娜，洪 浩，張正勇

（南京財經大學 管理科學與工程學院，江蘇 南京 210023）

乳制品作為消費者日常食品購買的重要組成部分，尤其是滿足嬰幼兒營養需求的重要食品來源，其質量安全問題一直深受我國市場主管部門和大眾的關注，然而近年來，國內外乳制品相關質量安全問題仍時見報道，為此，國家“十四五規劃綱要”明確提出要加強和改進食品安全監管制度，完善食品安全法律法規和標準體系，深入實施食品安全戰略，著力提高食品安全檢測技術[1]。針對乳制品質量安全風險，目前管控和研究策略主要包括：① 建立健全國家乳制品相關產品標準、檢測標準；② 研究開發各類先進檢測方法。如李濤等[2]研究建立了一種基于超高效液相色譜-質譜的乳粉中16種喹諾酮類藥物檢測方法；Mendes等[3]運用拉曼光譜結合主成分分析、偏最小二乘回歸法進行了生牛奶中乳清的檢測；Li等[4]研究構建了一種基于表面增強拉曼光譜的側向流免疫傳感器，可實現牛乳中黏菌素的快速識別。

不過現有研究主要集中于乳制品具體指標成分的測定方面，在乳制品整體品質控制方面研究案例還相對較為匱乏，突出表現在目前“海淘”過程中偽品、次品時有出現，以次充好“假乳粉”事件等，而偽次品各項指標可能是符合國家最低限定標準，造成新的監管困境，因此，迫切需要發展乳制品的品質快速判別新方法。本文提出了乳制品特征譜圖分析思路，以牛、羊乳粉為例，從傳統拉曼光譜、二維相關拉曼光譜兩個方面構建牛、羊乳粉特征譜圖，并進一步結合相似度分析算法量化分析了牛、羊乳粉譜圖間的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用牛、羊乳粉：南京蘇果超市。

1.2 儀器與設備

Prott-ezRaman-D3型激光拉曼光譜儀：激光波長785 nm，激光最大功率約為450 mW，CCD檢測器溫度控制在-85 ℃，積分時間為50 s，掃描次數為1次，光譜采集范圍為250～2 000 cm-1，光譜分辨率為1 cm-1，美國Enwave Optronics公司；96孔板：美國Corning Incorporated公司。

1.3 方法

1.3.1 譜圖數據采集方法

取適量乳粉粉末樣品置于96孔板的各自獨立小孔內，使得小孔恰好處于充滿狀態。而后，使用激光拉曼光譜儀光纖探頭對準樣品直接進行照射測試，收集信號，即得到樣品的拉曼光譜數據。調節激光功率，分別在約255、320、385、450 mW條件下獲取實驗樣品的拉曼光譜數據，用以構建三維拉曼光譜圖。

1.3.2 譜圖數據分析方法

拉曼光譜數據經光譜儀自帶軟件進行基線校正（SLSR Reader software 8.3.9，美國Enwave Optronics公司）、小波降噪處理（Matlab軟件，美國Math Works公司），而后，使用2D-Shige軟件（Shigeaki Morita，日本Kwansei-Gakuin大學）進行動態拉曼光譜數據的二維相關分析，得到樣品的二維相關拉曼光譜圖。

針對羊、牛乳粉的拉曼光譜和二維相關拉曼光譜數據，分別從相似性相似度、差異性相似度兩方面進行樣品的相似度分析。相似性相似度是衡量各光譜內在化學成分配比的相似程度，研究選取了相關系數法、向量夾角余弦法；差異性相似度是衡量兩譜圖間的差異，研究選取了歐氏距離法。

運算平臺：MATLAB R2018a（美國MathWorks公司）。

2 結果與分析

2.1 牛、羊乳粉的拉曼光譜分析

羊乳不含牛乳中某些可能導致過敏的異性蛋白，因其脂肪和蛋白質顆粒也相對較小更易于被人體消化吸收，乳蛋白、免疫球蛋白含量較高，脂肪碳鏈較短等特點，受到消費者的廣泛認可[5]。由于羊乳的產量較牛乳少很多，且價格普遍高于牛乳，因此，有必要建立牛、羊乳制品的特征譜圖，加強對牛、羊乳的品質管控。拉曼光譜是近年來得到飛速發展的一種散射光譜技術，具有譜圖數據采集速度快，樣品前處理耗時少甚至無需樣品前處理等特點，并且可便攜化，十分適用于現場快速檢測[6]。實驗以牛、羊乳粉為研究對象，采集了其在不同激光功率條件下的拉曼光譜信號，如圖1、圖2所示。首先，可以參考已有文獻[7-12]對譜圖中的光譜峰進行物質歸屬分析，如在1 750 cm-1附近出現的拉曼光譜峰主要可能是源于與脂肪有關的酯C＝O伸縮振動，牛乳的光譜最高峰出現在1 460 cm-1，其主要是與源自糖類、脂肪的CH2變形振動有關，而羊乳的光譜最高峰出現在1 090 cm-1附近，主要是與源自糖類有關的C—O伸縮振動、C—C伸縮振動以及C—O—H變形振動，在1 010 cm-1附近出現的拉曼光譜峰是一個較為特殊的峰，其主要是與樣品所含的蛋白質中苯丙氨酸的苯環振動有關，此外，通過譜圖分析還可發現，羊乳在1 025 cm-1處出現的光譜峰較牛乳更為尖銳，羊乳在882 cm-1和385 cm-1處出現光譜峰，而牛乳在這兩處沒有明顯的光譜峰，更多的光譜峰歸屬見表1。由此看出，通過拉曼光譜表征可以顯示出牛、羊乳粉豐富的物質組成信息，主要含有脂肪、糖類和蛋白質分子，有個別拉曼光譜峰僅羊乳顯現，在拉曼光譜的峰型、峰位置、峰強度方面，牛、羊乳粉譜圖表現出明顯不同，反映出牛、羊乳物質組成有一定差異。其次，從圖中還可以看出，不同激光功率條件下，牛、羊乳樣品的拉曼光譜峰呈現出一定的變化規律，比如在255 mW時，僅有少量的譜峰出現，隨著激光功率增大，大量的譜峰開始出現，且譜峰強度明顯增強，表現出一定的動態變化特征。

表1 牛、羊乳粉主要的拉曼光譜峰可能歸屬

圖1 不同激光功率下牛乳粉拉曼光譜圖

圖2 不同激光功率下羊乳粉拉曼光譜圖

2.2 牛、羊乳粉的二維相關拉曼光譜分析

前述分析揭示出牛、羊乳粉拉曼光譜隨著外界條件變化呈現出一定的動態變化特征，據此可進一步開展二維相關分析，該技術是由Noda等[13-15]提出的一種新型光譜數據處理方案，基本思路就是收集樣品在外擾作用下動態譜圖，而后運用相關分析方法，實現多張譜圖的重構融合，構建樣品在三維空間中的特征譜圖。為減少光譜采集過程中隨機噪聲對后續三維譜圖構建的影響，實驗采用小波降噪的方法進行了光譜預處理，選擇coif1小波基，有效消除了光譜噪聲[16]。進一步對上述降噪后的4張光譜數據，以平均峰為參考峰，運用二維相關分析法進行了三維譜圖構建，圖3為牛乳粉的二維相關拉曼光譜同步圖，其最大的自動峰為（1 666，1 666），其他自動峰有（1 455，1 455）、（1 326，1 326）、（1 100，1 100）、（856，856）等，交叉峰有（1 455，1 660）、（1 290，1 440）、（1 100，1 290）、（870，1 110）等，由于動態光譜信號是隨著激光強度增強依次增大的，故在新構建的三維光譜圖中相關光譜信號均為正相關，數值為正值。采用同樣的處理方法，得到羊乳粉的二維相關拉曼光譜同步圖，如圖4所示，自動峰有（1 666，1 666）、（1 455，1 455）、（1 265，1 265）、（1 100，1 100）、（870，870）、（366，366）等，交叉峰有（1 455，1 666）、（1 300，1 445）、（1 100，1 300）、（1 100，1 460）、（876，1 090）、（870，1 455）等，可以看出，牛、羊乳粉在三維空間特征譜圖上差異顯著，羊乳粉的出峰數量明顯較多。

圖3 牛乳粉二維相關拉曼光譜同步圖

圖4 羊乳粉二維相關拉曼光譜同步圖

2.3 羊、牛乳粉的拉曼光譜相似度分析

基于拉曼光譜、二維相關拉曼光譜可表征樣品豐富的化學組成、光譜特征信息，并可進行直觀的肉眼鑒別，但是尚難給出樣品間定量化的判別分析，因此，實驗進一步結合相似度算法，進行量化分析[17]。實驗隨機選取了3個牛乳粉樣品數據和3個羊乳粉樣品數據，分別計算這6個樣品數據之間的相似度。以各樣品在450 mW條件下測試獲取得拉曼光譜并經小波降噪后數據為輸入，相關系數法計算得到牛乳粉樣品間相關系數值為0.996 5～0.998 2，羊乳粉樣品間相關系數值為0.985 7～0.998 6，而牛、羊乳粉樣品間相關系數值為0.947 0～0.972 2。向量夾角余弦系數計算得到牛乳粉樣品間夾角余弦值為0.997 7～0.998 8，羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.990 8～0.999 1，牛、羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.965 8～0.981 7。歐氏距離計算得到牛乳粉樣品間歐氏距離為4.286 0×103～8.813 0×103，羊乳粉樣品間歐氏距離為1.028 9×104～1.434 1×104，羊、牛乳粉樣品間歐氏距離為2.080 9×104～3.847 9×104，如表2所示。

表2 拉曼光譜歐氏距離計算結果 ×104

以樣品二維相關拉曼光譜數據為輸入，相關系數法計算得到牛乳粉樣品間相關系數值為0.994 9～0.997 3，羊乳粉樣品間相關系數值為0.978 2～0.997 9，而牛、羊乳粉樣品間相關系數值為0.921 9～0.958 0。向量夾角余弦系數計算得到牛乳粉樣品間夾角余弦值為0.995 5～0.997 6，羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.980 5～0.998 1，牛、羊乳粉樣品間夾角余弦值為0.931 0 ～0.962 6。歐氏距離計算得到牛乳粉樣品間歐氏距離為6.395 0×107～1.632 5×108，羊乳粉樣品間歐氏距離為2.019 8×108～3.097 2×108，牛、羊乳粉樣品間歐氏距離為4.679 0×108～8.510 3×108，如表3所示。

表3 二維相關拉曼光譜歐氏距離計算結果 ×108

定量化的分析結果揭示出：① 無論是相關系數、夾角余弦，還是歐氏距離，結果均顯示出牛、羊乳粉同品種樣品間具有較高的相似度，而牛、羊乳粉不同品種樣品間則表現出較大的差異度。同時，較之相關系數、夾角余弦值，歐氏距離刻畫牛、羊乳粉樣品間的差異性更為明顯。② 與直接使用拉曼光譜結合相似度運算相比，二維相關拉曼光譜在揭示牛、羊乳粉樣品內相似樣品之間的差異方面，可提供更高的譜圖分辨率，因而相關系數、夾角余弦值表現出下降的趨勢，歐氏距離值則表現出增大的趨勢。

3 結 論

實驗提出并構建了牛、羊乳粉的多維拉曼光譜特征譜圖表征方案，系統論證并定量化評估了牛、羊乳粉同品種樣品間相似、不同品種樣品間差異情況。拉曼光譜呈現了樣品豐富的特征組分信息，二維相關拉曼光譜則呈現了樣品動態變化特征，進一步結合相關系數、夾角余弦和歐氏距離算法，定量化分析結果揭示出牛、羊乳粉間的差異性較大，且二維相關拉曼光譜圖分辨率更高，可實現樣品有效判別。該實驗方案具備在牛、羊乳粉鑒別、質量控制等多個方面的潛在應用價值，并且這種多維特征譜圖構建和多層次分析思路也可為其他食品的質量安全監管提供借鑒。