基于高通量測序的清水竹筍加工關鍵環節細菌污染狀況分析

戴奕杰，湯嬌嬌，李 珂

(1.貴陽學院 生物與環境工程學院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室，貴州 貴陽 550005；3.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410125）

竹筍廣泛分布于中國長江以南地區。因其具有的生長季節性限制，新鮮竹筍并不能得到全年供應，而采后迅速木質化降低了新鮮竹筍的營養品質和適口性。同時，新鮮竹筍會發生褐變或變黃，尤其集中體現在采收時的切面。采后貯藏措施可以延長竹筍的貨架期，但不能保證竹筍的全年供應。為此，對新鮮竹筍進行不同的加工處理是必要的，包括發酵、煮沸、熱燙、罐裝和腌制。其中，罐裝、干燥和發酵最為常見[1]。竹筍在剝殼、挑選、整形等加工環節必然會產生以筍殼、筍頭以及預煮水等為主的廢棄物，這些廢棄物堆積后若得不到及時處理，微生物生長繁殖加劇，將污染竹筍加工廠周圍環境。

食源性疾病是指通過攝食而進入人體的有毒有害物質等致病因子所造成的疾病。可分為感染性和中毒性，包括常見的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病以及化學性有毒有害物質所引起的疾病[2]。根據竹筍加工廠的竹筍預處理過程，在新鮮竹筍剝殼后極易受到操作者攜帶的病菌污染，隨后進行預煮環節[3]，雖經過高溫處理，但仍有耐熱致病菌芽孢存在，二次供水的清潔程度也會直接影響竹筍制品安全性，進入操作臺后工作人員在挑選、整形過程的不當操作也可能導致竹筍制品的安全隱患。

本研究擬對竹筍加工廠二次供水及竹筍分割整形操作臺上竹筍殘渣進行采樣，通過菌落總數測定、16S rDNA擴增子測序結合Tax4Fun功能預測分析該竹筍加工廠微生物污染情況，重點關注與人類疾病密切相關致病菌的相對豐度及基因表達狀況，為竹筍加工廠食源性疾病的預防提供理論依據，并提出相應對策建議。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

竹筍加工廠二次供水以及操作臺上竹筍邊角料等竹筍殘渣：湖南某竹筍加工企業；NaCl（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；平板計數瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

NovaSeq6000型高通量測序分析儀：美國Illumina公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：美國Axygen Biosciences公司；QuantiFluor?-ST：美國Promega公司；TS-2102C型立式恒溫振蕩器：上海天呈實驗儀器制造有限公司；XK97-A型菌落計數器：姜堰市新康醫療器械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法對樣本的基因組脫氧核糖核酸（DNA）進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇通用引物 515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴增DNA中V3、V4區域。使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs 公 司 的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行聚合酶鏈式反應（PCR），確保擴增效率和準確性。

1.3.2 PCR產物的混樣和純化

PCR產物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化，采用酶標定量，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用荷蘭Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。

1.3.3 文庫構建和上機測序

使 用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。

1.3.4 菌落總數測定

菌落總數測定依據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行。具體步驟：無菌條件下稱取25 mL二次供水以及25 g竹筍殘渣樣品于225 mL具有適量無菌玻璃珠的生理鹽水中，在恒溫振蕩器（120 r/min）震蕩2 min后，用生理鹽水進行稀釋。取10-1和10-2稀釋度樣品各1 mL，分別用（46±1） ℃的滅菌平板計數瓊脂15～20 mL傾注平皿，轉動混勻，每個稀釋度傾注兩個平皿。待瓊脂凝固后倒置平板，經（36±1）℃培養（48±2）h后，用放大鏡和菌落計數器記錄稀釋倍數和相應的菌落數量，菌落計數以菌落形成單位（CFU）表示，每批次樣品檢測3份。

2 結果與分析

2.1 菌落總數

通過對竹筍加工廠二次供水和竹筍殘渣菌落總數檢測，二次供水中檢測到菌落總數為1.5×102CFU/mL，竹筍殘渣中檢測到的菌落總數為9.2×103CFU/g，可以發現竹筍殘渣微生物總量更大，受污染更嚴重。

2.2 細菌序列豐度及多樣性分析

如圖1（a）所示，所有樣品曲線形狀相似均趨于平坦，說明6個樣品細菌組成均勻程度相近。如圖1（b）所示，6個樣品的曲線均趨于平坦，說明測序數據足以覆蓋所有的細菌，表明6個樣品中細菌具有多樣性。二次供水的Shannon指數［圖1（c）］和Simpson指數［圖1（d）］均高于竹筍殘渣，說明二次供水中的細菌多樣性高于竹筍殘渣，而且ACE指數［圖1（e）］和Chao1［圖1（f）］越高表明二次供水的物種豐富，分配更均勻。

圖1 竹筍殘渣及二次供水的序列豐度及Alpha-多樣性

2.3 細菌群落結構分析

Venn圖可以更加直觀的表現出樣品獨有和共有的操作單元（OUT）數目，表現樣本的OTU數目組成相似性及重疊情況。圖2為竹筍加工廠二次供水及竹筍殘渣中OTU數目的重疊情況，重疊OTU數目為79，占總OTU數目的56.43%，二次供水和竹筍殘渣獨有的OTU數目分別為40和21，占總OTU數目的28.57%、15.00%，說明兩個樣本間微生物之間存在一定相似性。

圖2 OUT水平上的Venn圖

主坐標分析（PCoA）是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數據中提取出最主要的元素和結構[4]。本研究基于Weighted Unifrac距離來進行PCoA分析，并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖展示。由圖3可以看出，竹筍加工廠二次供水和竹筍殘渣組內三點之間呈現明顯聚集狀態，說明組內菌落結構差異較小；而二次供水與竹筍殘渣兩樣品組間距離相差較大，說明竹筍加工廠二次供水和竹筍殘渣之間菌落結構有一定差異。

圖3 基于Unweighted UniFrac距離的PCoA圖

2.4 物種相對豐度柱狀圖

如圖4所示，竹筍水及竹筍廢棄物中相對豐度排名前15的細菌為巴黎鏈球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸明串珠菌、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、大腸桿菌、棉籽糖乳球菌（Lactococcusraffinolactis）、武侯氏不動桿菌、鯨魏斯氏菌（Weissellaceti）、炭疽芽孢桿菌、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、加納魏氏菌（Weissella ghanensis）、睪酮假單胞菌（Comamonastestosteroni）、熱死索絲菌（Brochothrixthermosphacta）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

圖4 細菌屬水平、種水平相對豐度柱狀圖

巴黎鏈球菌是一種條件致病菌，可能具有毒力島和致病基因[5]，可通過入侵腸道導致兒童腹瀉。Marmolin等[6]研究了鏈球菌的不同亞種對人類感染性心內膜炎和胃腸道疾病之間的可能聯系，強調了巴黎鏈球菌導致的菌血癥患者的1年致死率達到66.7%。此外，診斷為巴黎鏈球菌導致菌血癥的患者中，26.3%患有癌癥，并且這些癌癥中的80%在胃腸系統之外，除非進行諸如核磁共振成像或正電子發射斷層掃描之類的檢查，否則難以診斷。王麗君[7]從乳房發炎的奶牛乳樣中通過16S rRNA基因克隆測序確定巴黎鏈球菌2株，表明巴黎鏈球菌是潛在導致奶牛乳腺炎的致病菌，這與Chen等[8]對患乳腺炎奶牛分離的巴黎鏈球菌研究相一致。Almuzara等[9]研究表明巴黎鏈球菌可能會促進細胞內侵襲，而隨后侵入宿主細胞保護細菌免受抗菌劑的侵害，并導致慢性感染的發展。巴黎鏈球菌在二次供水和竹筍殘渣中平均相對豐度分別為0.207和0.554，均占據首位。

不動桿菌是一類革蘭氏陰性菌[10]，其中某些菌種是條件致病菌。有關武侯氏不動桿菌研究較少，該菌于2018年被Hu等[11]首次檢測出，其病理學作用機制仍需進一步挖掘研究。熱死索絲菌為革蘭氏陽性微需氧無芽孢菌[12]，主要存在于肉制品中，是真空、冷凍包裝肉制品主要腐敗菌之一[13-14]。大腸桿菌是常見病原菌，呈革蘭氏陰性，存在于生物腸道內，在一定條件下可以引起人體發生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染[15]，在竹筍加工廠二次供水中平均相對豐度為0.013 0，居于第6位，在竹筍殘渣中平均相對豐度為0.003 8，居于第8位。炭疽芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，芽孢抗毒性強，可導致家畜、人類患炭疽病。在二次供水及竹筍殘渣中平均相對豐度分別為0.001 8、0.000 5。

2.5 Tax4Fun功能預測

Tax4Fun功能預測是通過基于最小16S rRNA序列相似度的最近鄰居法實現的[16]，其具體做法為提取KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列并利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）算法將其比對到SILVA SSU Ref NR數據庫（BLAST bitscore＞1 500）建立相關矩陣，將通過UProC和PAUDA兩種方法注釋的KEGG數據庫原核生物全基因組功能信息對應到SILVA數據庫中，實現SILVA數據庫功能注釋。測序樣品以SILVA數據庫序列為參考序列聚類出OTU，進而獲取功能注釋信息。

如圖5所示，二次供水及竹筍殘渣中化能異養型生物及發酵作用基因表達平均值較高，化能異養生物可分為腐生型和寄生型[17]，腐生型可從無生命有機物獲得營養物質，會引起食品腐敗變質，如毛霉、根霉以及芽胞桿菌[18]等。寄生型生物必須寄生在活的有機體內，從寄主體內獲得營養物質[19]，能夠引起動植物的微生物病害，如普遍存在的鏈球菌和大腸桿菌。發酵作用微生物主要以乳球菌、乳桿菌以及明串珠菌占優勢，且竹筍殘渣發酵作用極顯著高于二次供水（P=0.007）。二次供水中表達量高且顯著高于竹筍殘渣的表達基因是植物病原體（P＜0.001），竹筍殘渣中表達量高且與二次供水具有顯著區別的基因有人類病原體（P=0.027）以及寄生蟲（P=0.027）。

圖5 KEGG聚類T-Test分析圖

3 結論與討論

本文針對竹筍加工廠二次供水及竹筍殘渣進行菌落總數測定，發現竹筍殘渣中菌落總數顯著高于二次供水，表明竹筍殘渣受微生物污染嚴重。通過16S rDNA擴增子測序分析、Venn圖和PCoA分析表明竹筍加工廠二次供水和竹筍殘渣微生物群落結構具有一定的相似性，可能是竹筍殘渣長時間堆放發酵，微生物快速生長繁殖，導致工廠周圍水資源中的微生物群落結構改變，并趨于一致。物種相對豐度圖中顯示竹筍加工廠二次供水和竹筍殘渣中top5細菌為巴黎鏈球菌、乳酸乳球菌、食竇魏斯氏菌、乳酸明串珠菌、發酵乳桿菌。其中巴黎鏈球菌已經被證明可通過食物進入人體腸道，入侵宿主細胞保護致病菌，促進細胞內侵害，誘導腹瀉、痢疾等腸道疾病。本研究發現巴黎鏈球菌在竹筍殘渣中的相對豐度高于二次供水，推測竹筍殘渣是巴黎鏈球菌主要來源。二次供水和竹筍殘渣中還具有其他相對豐度較高的條件致病菌，如武侯氏不動桿菌、熱死索絲菌、大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌等均可能通過食物導致人體患腸道、皮膚疾病。進一步通過Tax4Fun功能預測分析二次供水及竹筍殘渣中與致病微生物基因表達相關聯的功能特性，發現二次供水及竹筍殘渣中化能異養型生物基因表達量最高，通常以寄生細菌為主，特別是相對豐度較高的巴黎鏈球菌。二次供水植物病原體基因表達量顯著高于竹筍殘渣，而竹筍殘渣中人類病原體及寄生蟲相關基因表達量高于二次供水，表明二次供水及竹筍殘渣中均含有對人體有害微生物，并且其基因表達量較高，直接影響竹筍加工制品安全性[20-21]。

顯然，竹筍加工廠二次供水及竹筍殘渣均在一定程度上受到致病微生物污染。因此，提高企業衛生安全意識，加強衛生監管工作，有效控制操作人員衛生狀況是十分必要的。

竹筍加工廠二次供水及竹筍殘渣中發酵用細菌相對豐度較高，通過Tax4Fun功能預測也側面表明了關于食品發酵基因表達較高，這也為竹筍加工廠提供豐富的微生物資源，可針對二次供水及竹筍殘渣進行微生物培養分離鑒定，將分離得到的具有益生性能的細菌接種于竹筍殘渣中，從而抑制其他腐敗微生物生長繁殖，有效控制微生物污染周圍水資源，再將發酵后竹筍殘渣制備成青貯飼料等進行二次利用[22]。因此，將竹筍殘渣及時收集并利用乳酸菌發酵處理，既能夠解決竹筍加工廠水資源微生物污染以及竹筍殘渣腐敗發臭問題，又能提高竹筍加工廠的經濟效益。與此同時，二氧化氯作為新型消毒劑，在果蔬、水產品、飲品中具有高效安全性[23]。竹筍廠在對二次供水進行處理時，可在其中加入0.7 mg/L二氧化氯[24]進行殺菌消毒；竹筍整形階段，間隔1 h用二氧化氯水清洗臺面，可以有效控制微生物污染。