一株大腸桿菌噬菌體的分離鑒定與系統進化分析

付 強，趙修報，王艷，苗立中，于金枝，張莎莎，程立坤

（1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

噬菌體是侵襲細菌的病毒，是自然界中最為普遍和分布最廣的群體（Suttle等，2021），其必須在活菌內寄生，有嚴格的宿主特異性。噬菌體可作為分子生物學研究的試驗工具（Bertoglio等，2020）以及用于檢測和控制致病菌，比如噬菌體療法等（Pirnay等，2021），但在細菌發酵生產中會帶來無形的威脅。本試驗通過對噬菌體的研究，以了解其生長規律、進化特性，為更好的利用和防治積累經驗。

1 材料與方法

1.1 噬菌體樣品和菌株 大腸桿菌BL21株，污染噬菌體的發酵液。

1.2 主要試劑 SM 液：NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，明膠0.1 g，1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）50 mL，加水定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。普通LB 瓊脂和0.7%上層半固體LB 瓊脂，按常規方法制備。Trans15K DNA Marker，北京全式金生物技術有限公司；常規限制酶EcoR V、EcoR Ⅰ等，寶生物工程有限公司。

1.3 噬菌體的分離與純化 取10 mL 變清的發酵液8000 r/min 離心10 min，獲取上清液后用0.22 μm 濾器過濾除菌后備用。取10 μL 樣品液與0.5 mL 對數生長期正常菌液混合，室溫放置10 min，將混合物與5 mL 上層半固體瓊脂混合后，立即傾倒于LB 固體培養基上。待凝固后，37 ℃培養12 h，挑取單個空斑，純化3 次。將純化的噬菌體加入甘油至30%濃度，-80 ℃保存。

1.4 最佳感染復數測定（MOI）參考張琳等（2013）的方法，將宿主菌培養至對數生長前期，調菌液麥氏濃度為0.5，相當于1×108cfu/mL。按照感染復數分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 的比例，加入噬菌體純培養液和宿主菌，在36 ℃搖床中150 r/min 培養3.5 h后，12000 r/min 離心10 min收集上清液，測定噬菌體的效價。以產生最高噬菌體效價的MOI 為最佳感染復數。試驗重復3次，設置不加噬菌體的宿主菌培養液為試驗對照。

1.5 一步生長曲線的測定 參考 Koonjan 等(2020）方法，將宿主菌培養至對數生長初期（D600為0.1～0.2），按照最佳感染復數比例接種噬菌體YHphg-1，室溫吸附10 min。將混合物1 mL 離心1 min（12000 r/min），沉淀重懸于1 mL LB 培養基，再轉入37 ℃條件預熱的100 mL 液體培養基，37 ℃、200 r/min 培養。同時開始計時，在0 時刻和每隔10 min 取樣一次，連續取樣120 min，取上清用雙層平板法測定噬菌體效價。以感染時間為橫坐標，噬菌體的效價為縱坐標，繪制一步生長曲線。試驗重復3次，取其平均值。

1.6 噬菌體的測序與鑒定

1.6.1 噬菌體基因組提取 按鞠磊等（2016）的方法，取固體增殖后效價達109pfu/mL 的噬菌體液1 mL 轉移至離心管，12000 g 離心5 min，去沉淀，取上清液，加200 mL 2.5 mol NaCl 20% PEG8000混合，室溫15 min。4 ℃、12000 g 離心5 min，棄上清，再離心30 s，棄上清。加100 μL TE（pH 8.0），室溫泡30 min，振蕩溶解，加入5 μL DNase I（20 mg/μL），5 μL RNase A（20 mg/mL）和10 μL DNase I Buffer，在37 ℃水浴鍋中孵育1 h，利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取噬菌體基因組，冷凍保存備用。

1.6.2 噬菌體的限制性酶切 在預試驗中，選用了一些限制性內切酶消化噬菌體基因組DNA，以篩選能夠切割噬菌體基因組的限制性內切酶。按預試驗結果，采用EcoR I、EcoR V 和Sal I 進行酶切噬菌體基因組，經1.0%瓊脂糖凝膠120V 電泳25 min，觀察酶切情況并拍照留存。

1.6.3 重組質粒的構建 將用EcoR V 酶切后的基因組DNA，用taq 酶72 ℃反應10 min，最后將反應產物電泳并切膠回收2～3 kb 的DNA 片段。按常規操作取回收片段與pBLUE-T 載體連接，將連接產物電轉化入感受態細菌DH5a中，涂麥康凱平板（Amp+）37 ℃培養16 h，次日挑取無色菌落，EcoR Ⅰ酶切檢測陽性菌，擴大培養后提取質粒送上海生物工程股份有限公司測序。

1.6.4 統計繪圖與測序數據分析 利用ggplot2軟件包（Ginestet，2011）進行統計繪圖。使用在線Blastn 工具比較核酸序列的同源性。使用pDRAW32 軟件，選擇限制性內切酶對噬菌體基因組進行電子酶切。利用MEGA-X 軟件（Version 10.2），根據噬菌體核酸序列測序結果構建進化樹，用ggtree（v3.1.3）（Yu，2020）構圖，參考ICTV最新公布的2019 病毒分類系統，完成噬菌體種屬的分類圖。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離與純化 從感染的發酵液中成功分離并純化出1 株噬菌體，命名為YHphg-2019。噬菌斑形態為圓形，直徑3～4 mm，有暈環（圖1）。據報道，暈環的形成與噬菌體釋放的多糖解聚酶有關（Latka等，2017）。

2.2 噬菌體的最佳感染復數 從表1 中可以看出，當MOI=0.01時，噬菌體YHphg-2019 增殖后測定得到的噬菌體效價最高，為6.7×1011pfu/mL。因此噬菌體YHphg-2019 的最佳感染復數為0.01。

表1 噬菌體YHphg-2019最佳感染復數的測定

2.3 噬菌體的一步生長曲線 由圖2 可知，噬菌體YHphg-2019 與生長對數期的宿主菌混合20 min 曲線走勢無明顯變化，即判斷該噬菌體的潛伏期約為20 min。在20～80 min，噬菌體的滴度開始增加，而超過80 min 后曲線平穩，即判斷該噬菌體的裂解時間約為80 min，因此，可得裂解量為1.86×109pfu/mL/ 1×107cfu/mL＝186 pfu/cell，即噬菌體YHphg-2019 感染宿主菌的裂解量約為186 pfu/cell。

圖2 噬菌體YHphg-2019 的一步生長曲線

2.4 噬菌體基因組的酶切圖譜 基因組隨機文庫的構建一般是通過超聲波法或酶切法，這里選用酶切法，3 種限制性內切酶酶切效果如圖3 所示。

圖3 噬菌體YHphg-2019 基因組的酶切圖譜

可以看出，EcoR V 酶切后在3 kbp 處有明顯條帶，為了提高連接的成功率，選用EcoR V 的酶切產物用于噬菌體隨機文庫的構建。

2.5 噬菌體基因片段的克隆及質粒篩選 切膠產物克隆入pBLUE-T 質粒中，重組質粒經EcoRⅠ酶切后，出現大小不一的條帶，這里選擇4 號質粒送交測序（圖4）。在細菌重組子的篩選方面，由于是單酶切片段連接，假陽性較高，常規方法通常為藍白斑篩選，本試驗采用了麥康凱培養基，陽性菌載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端被插入片段打斷，無法與宿主菌E.coli DH5a 實現α-β 互補，菌落呈現無色（反之顯紅色），從而提高陽性檢出率。試驗證實，雖然無法杜絕，但可有效降低假陽性。

圖4 重組質粒酶切鑒定

2.6 測序結果分析 測序數據顯示DNA 片段大小為2608 bp，經Blastn 比對分析，與Escherichia phage vB_EcoS_SH2（NC_047828）、Escherichia phage JMPW2（NC_041873）相似度最高，Identities值 為97.13%，與Enterobacteria phage vB_EcoS_IME167（MH051912）、Escherichia virus T1（AY216660）、Shigella virus Sfin-3（NC_049831）等菌株相似度也在90%以上。以EscherichiaphagevB_EcoS_SH2 為參考株，經進一步分析，測序片段主要編碼尾絲蛋白，確定屬于尾噬菌體目（Caudovirales）。

2.7 噬菌體基因組的電子酶切圖譜 使用限制性內切酶來確定基因組大小對噬菌體的分類和相互區分具有重要意義，組間的差異可以通過酶切位點表現出來（González-Villalobos等，2021），選擇三株相似度高的噬菌體菌株進行電子酶切，如圖5 所示。對比圖3、圖5 可以看出，在EcoR Ⅰ、EcoR V 酶切條件下，噬菌體YHphg-2019 與Escherichia phage vB_EcoS_SH2（NC_047828）表 現出較一致的酶切圖譜，但在Sal Ⅰ酶切條件下又存在明顯差異，反應出種間特異性。需要說明的是，通過計算機模擬的酶切圖譜和實際效果還是有區別的。

圖5 噬菌體基因組的酶切電子圖譜

2.8 噬菌體尾絲蛋白系統進化樹 國際病毒分類委員會（ICTV）于2020 年3 月批準了最新的2019 病毒分類系統，新準則在前一準則文件的基礎上全面采用了十五級分類階元，分別為：域、亞域、界、亞界、門、亞門、綱、亞綱、目、亞目、科、亞科、屬、亞屬、種（Adriaenssens等，2020）。大多數噬菌體屬于有尾噬菌體目（Caudovirales），具有尾絲蛋白，能特異性識別并結合宿主菌表面的受體（Black等，2012）。較熟悉的有Myoviridae（肌尾噬菌體科）、Siphoviridae（長尾噬菌體科）、Podoviridae（短尾噬菌體科）以及新加的Drexlerviridae（科），資料顯示尾絲蛋白具有一定保守性（Koonjan等，2020），根據噬菌體尾絲核酸序列構建進化樹，如圖6 所示。從進化樹可以看出，長尾噬菌體科（HK446 和HK97）作為外群，噬菌體YHphg-2019 與SH2、JMPW2 等處于最近分支，結合最新的2019 病毒分類系統，屬于Tunavirus（屬）。

圖6 根據尾絲蛋白繪制的噬菌體家族進化關系

3 結論

本試驗從發酵液中分離到一株烈性噬菌體YHphg-2019，幸運的是其宿主范圍較窄，通過輪換其他菌株減少了再次污染幾率。試驗還證實采用麥康凱抗性板“紅白斑”篩選代替“藍白斑”篩選的可行性。

該噬菌體基因組沒有通過二代高通量測序儀測序，僅通過鳥槍法（shot-gun) 獲得部分隨機序列，來達到菌種鑒定的目的。為了提高準確性，采用物理酶切和電子酶切圖譜進行了整體基因組的比較，可看出具有一致性的同時還存在種間差異。實驗選擇≥95%的DNA 序列同一性作為該屬物種劃分的標準（Evelien等，2017）。結合系統發育樹和Blastn 分析，認為噬菌體分離株YHphg-2019 屬于Duplodnaviria（域）、Heunggongvirae（界）、Uroviricota（門)、Caudoviricetes（綱）、Caudovirales（目）、Drexlerviridae（科）、Tunavirinae（亞科）、Tunavirus（屬）。