亞麻籽膠濃度對大豆分離蛋白功能特性的影響

趙榮敏

（石家莊職業技術學院食品與藥品工程系，河北石家莊 050081）

大豆分離蛋白（SPI）是大豆中重要的營養成分之一，在實際生產中具有廣泛的應用（Wang等，2017）。SPI 本身具有比較高的乳化活性和抗氧化能力，在一定程度上可以用于改善乳狀液的穩定性。然而，由于加熱溫度、酸堿度以及離子強度等因素，SPI 的穩定性受到影響（Wang等，2019）。水包油乳狀液通常是一種熱力學不穩定的多相體系，容易產生聚集、聚結以及絮凝等現象，因此通常可以通過添加穩定劑，例如兩親性聚合物和固體顆粒等，避免油相和水相之間發生相分離。

多糖是廣泛應用于許多食品膠體和乳劑配方的功能性成分，為天然聚合物。由于其與蛋白可以產生納米或微觀結構（聚集和凝膠），因此通常可以改變食品膠體的流變性能，影響食品產品的紋理和穩定性（Porfiri 和Wagner，2018）。作為一種天然的陰離子多糖，亞麻籽膠（FG）是從亞麻籽或殼中提取出來的一種優質物質。因其良好的親水效果對食品工業存在巨大應用潛力。研究發現，加入FG，在較高的pH 條件下，可以降低凝膠形成速度，有助于形成致密的三維凝膠網絡結構，同時提高凝膠強度，在研究FG 吸附在乳清蛋白表面的電位變化時發現，FG 含負電荷的多糖部分與蛋白質發生相互作用，主要通過影響兩者之間的靜電相互作用來維持乳液的穩定性（Khalloufi等，2009）。目前，主要是通過油水界面層的吸附動力學和膨脹黏彈性特性來研究蛋白質與多糖之間的相互作用。然而，SPI/FG 溶液在不同多糖濃度下的交聯聚集與乳液乳化性之間的關系尚不清楚。本研究的目的是評估FG 濃度對SPI/FG 溶液交聯聚集及其乳狀液穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 大豆油，購于河南滎陽陽光油脂集團有限公司。FG 為國產食品級，購于新疆綠旗企業有限公司。SPI，購自北京奧博克生物科技有限公司，其蛋白質含量為85%，水分含量為7%，灰分含量為3.2%。其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備 FE20 pH計，梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；AH-PILOT 型均質機，安拓思納米有限公司；L9 紫外-可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；Nano ZS-90 zeta 電位儀，英國馬爾文公司；BT-9300Z 激光粒度分布儀，深圳市力達信儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 SPI/FG 溶液的制備 溶液的制備參考Liu等（2013）的方法，并進行適當修改。在25 ℃下配制0.5%的SPI 溶液，4 ℃保存12 h 以上，以確保完全溶解。然后添加濃度為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的FG，將SPI/FG 溶液混合攪拌30 min，用0.01 M NaOH 調節pH 至7.0，4 ℃保存過夜。

1.2.2 SPI/FG 溶液總巰基和二硫鍵的測定 總巰基含量的測定依據Simplicio 等（1991）的方法：取1 mL 混合溶液加入8 mL 的Tris-甘氨酸，均質后10000 r/min 離心15 min（4 ℃）。取上清液4.5 mL 加入0.5 mL 10 mM Ellman's 試劑，并以含有4.5mL Tris-甘氨酸和0.5 mL 10 mM Ellman's 試劑作為對照，避光反應30 min后，于412 nm 處利用紫外分光光度計測量吸光值。巰基含量的計算采用13600 M/cm 的摩爾吸光系數進行表示，蛋白含量使用雙縮脲法測定。

二硫鍵的測定參考Pérez-mateos 等（1997）方法略作修改：取樣品2 g，分別與10 mL 的0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素（SD）（原子比3：40）和0.5 mol/L β-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl 和8 mol/L 尿素混合，pH 值調至7.0（SE）。混合并均質，4 ℃靜置1 h，10000 r/min 離心15 min。用SE 溶液中蛋白含量與SD 溶液中蛋白質含量之間表示二硫鍵含量。

1.2.3 乳液的制備 為了制備水包油乳液，將SPI溶液和FG（0%～0.4%）的樣品溶解在0.01 mol/L磷酸鹽溶液中（pH 7.0），室溫下500 r/min 攪拌3 h。然后與大豆油按照9：1 的質量比進行混合，于15000 r/min 下均質2 min，得到待測乳液。

1.2.4 乳化活性（EAI）和乳化穩定性（ESI）的測定 將制備好的乳液立即從距離管底部0.5 cm處取50 μL 新鮮乳狀液加入至含5 mL 0.1% SDS溶液的試管中，振蕩混勻后在500 nm 處測定吸光值記作A0，取均質10 min 后的乳狀液重復上述步驟記作A10。EAI（m2/g）及ESI（%）由以下公式計算得出：

式中：2 為2 倍；2.303 為換算系數；C 為蛋白濃度；φ 為乳狀液中油相的體積分數（V/V，本試驗的油相體積分數為0.2）；L 為比色皿光徑（本試驗選用光徑為1 cm 的比色皿）；D 為稀釋倍數（本試驗的稀釋倍數為100）；A0、A10分別為乳狀液0 min和10 min 時在500 nm 處的吸光值。

1.2.5 乳液粒徑的測定 調整蛋白質濃度為10 mg/mL 并進行測定。利用激光粒度儀測定乳液粒徑的大小。測定具體參數設置如下：物質折射率為1.520，介質為水，介質折射率為1.333。

1.2.6 乳液Zeta 電位的測定 將待測樣品放入樣品池，采用Zeta 電位儀進行電位測試，以評估靜電相互作用。測試參數為散射角90°，平衡時間60 s，測試溫度25 ℃。

1.2.7 乳液光學顯微鏡的測定 從底部吸取新鮮乳液200 μL 置于載玻片上，選擇光學顯微鏡觀察，用4×鏡頭尋找視野，后于10×鏡頭下進行微觀結構的觀察。

2 結果分析

2.1 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液總巰基的影響SPI 富含巰基，極易被外界自由基攻擊并轉化為分子間或分子內二硫鍵，導致蛋白質交聯聚集。如圖1 所示，與對照組相比，FG 添加可以顯著降低巰基的含量（P <0.05），說明FG 的添加對SPI 結構的展開具有顯著的抑制作用。而且，FG 為0.2%時巰基含量達到最低（P <0.05），原因可能是FG帶負電荷的羧基與SPI 中的巰基基團相互作用，導致SPI/FG 溶液中巰基含量降低。然而，較高的FG 濃度（0.3%和0.4%）則又增加巰基的含量（P >0.05）。這可能是因為較高濃度的FG 促進了蛋白質鏈的展開，致使巰基含量呈現上升的趨勢。

圖1 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液總巰基的影響

2.2 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液二硫鍵的影響 二硫鍵的變化通常可以用來表征蛋白質交聯的情況，從而可以得出蛋白質結構發生改變。圖2 所示的是不同濃度FG 對SPI 二硫鍵含量的影響。當FG 濃度為0%～ 0.2%時，二硫鍵含量顯著增加（P <0.05），這可能是由于FG 的添加可以增強體系間的疏水相互作用，使得蛋白分子間發生聚集，同時巰基之間彼此靠近，發生-SH/S-S 間交換反應，形成二硫鍵（Yongsawatdigul 和Sinsuwan，2007）。而在FG 含量為0.3%和0.4%時，二硫鍵含量均顯著降低（P <0.05），這可能是因為在較高的FG 濃度下，FG 可以與大部分蛋白質發生一定的相互作用，因此蛋白質之間的巰基不能發生相互作用而產生二硫鍵，從而降低二硫鍵的含量。

圖2 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液二硫鍵的影響

2.3 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液EAI 和ESI 的影響 從表1 中可以看出，隨著FG 濃度的增加，乳液EAI 顯著增強（P <0.05）。這可能是FG 對乳液中的脂肪顆粒產生了很好的包裹作用并且阻止了脂肪顆粒之間的聚集。另一方面，FG 有良好的乳化性，能促進蛋白質和脂肪間的相互作用，形成穩定性良好的乳液。而且，FG 的添加有效的改善了乳液的乳化穩定性，FG 濃度為0.2%時效果更好。可能是因為FG 的添加增強了乳液的靜電斥力，使更多的蛋白質聚集在油滴周圍，可以抑制顆粒聚集（Liu等，2018），增強穩定性，另一個原因可能是FG 的添加增強了乳液的黏度，改變油滴的添加比例，使穩定性增強。從表中可以看出，低濃度的FG 使乳液穩定性增強，較高濃度的FG 則降低了乳液的穩定性。在添加量為0.4%時乳液穩定性最差。這可能是因為低濃度的FG 吸附在油滴表面，填充界面縫隙，增強了乳液的穩定性，而隨著FG 濃度的增加，蛋白質開始與游離出來的FG 發生反應發生聚集，乳液變得不穩定。

表1 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液EAI 和ESI 的影響

2.4 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液平均粒徑的影響 蛋白質粒徑的大小與蛋白質的水合特性有密切聯系，直接影響著SPI 的加工品質。圖3 表示為不同濃度下FG 對SPI 平均粒徑的影響。從圖中可以看出，隨著FG 濃度的增加，SPI/FG 乳液體系的平均粒徑呈下降的趨勢。原因可能是適量的FG可以與SPI 發生相互作用，阻止了蛋白質和蛋白質之間的交聯聚集，蛋白粒徑較小。而在較高的FG 濃度下（0.3%和0.4%），SPI 的粒徑顯著增大（P <0.05）。通常SPI 粒度增大的主要原因是蛋白氧化以及二硫鍵水平的增加，與上文二硫鍵結果一致。但此處粒度增大還可能是因為SPI-FG 之間發生吸附作用而產生聚集，使蛋白質粒徑變大。綜上，在FG 濃度為0.2%時，體系粒徑較小。

圖3 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液平均粒徑的影響

2.5 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液Zeta 電位的影響 Zeta 電位的測量可以用來描述膠體顆粒之間的靜電相互作用。靜電相互作用在蛋白交聯聚集過程中表現斥力，蛋白質分子中幾乎所有的帶電基團都分布在蛋白質分子表面，Zeta 電位如果是負值，表明蛋白質呈負電荷。如圖4 所示，隨著FG濃度的增加，Zeta 電位的絕對值逐漸增加（P <0.05），表明蛋白質所帶負電荷逐漸增加，蛋白質展開程度增加。這可能是因為FG 與SPI 發生相互作用使蛋白質結構展開，內部疏水基團暴露，這與本文表面疏水性結論一致。然而，隨著FG 濃度的繼續增加，Zeta 電位的絕對值又逐漸降低。此時可能是因為FG 濃度過大，導致于SPI 的負電荷不均衡，發生了靜電斥力，反而促進了蛋白質之間發生聚集，導致表面電荷量反而降低。

圖4 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液Zeta 電位的影響

2.6 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液光學顯微鏡的影響 顯微觀察可以進一步顯示乳液的液滴大小以及乳液聚集或絮凝的情況。圖5 展示了添加不同濃度FG后，SPI/FG 乳液光學顯微鏡的變化。從圖中可以看出，添加FG 使所有處理組液滴變得致密且均一，液滴直徑均比對照組小。并隨著FG 濃度的增加，液滴直徑先顯著減小后又略微增大，且在FG濃度為0.2%時液滴直徑最小。這可能是因為FG 濃度為0.2%時，油滴被完全包裹并均勻分布以形成穩定的乳液；在FG 濃度增加至0.3%和0.4%時，液滴直徑略微增大。說明高濃度的FG 會導致乳液發生絮凝。并且光學顯微鏡結果與粒徑結果一致。

圖5 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液光學顯微鏡的影響

3 結論

適當濃度的FG 可以抑制蛋白之間的交聯聚集并提高乳液的乳化特性。加入FG后，SPI 巰基含量先降低后增加，二硫鍵含量與之相反。在濃度為0%～0.2%時SH 能抑制蛋白質的展開，削弱蛋白質-水相互作用，并形成均勻一致的乳液，且在濃度為0.2%時效果最顯著；但是，在濃度為0.3%和0.4%時，這些特性有所削弱。因此，適當控制FG 的濃度，可以得到乳化效果較好的SPI/FG 乳液。