產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株篩選及制備甘露寡糖產(chǎn)物分析

王佰濤，楊文玲，權(quán)淑靜，雷高，李珊珊，劉德海

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州 450008）

β-甘露聚糖酶，又稱(chēng)β-1，4-D-甘露聚糖酶，是能夠水解β-1，4-糖苷鍵的一種內(nèi)切酶（Srivastava等，2017），在自然界廣泛存在，特別是微生物來(lái)源居多，在細(xì)菌的芽孢桿菌屬和真菌的曲霉屬比較常見(jiàn)（Piwpankaew等，2014；vanZyl等，2010）。β-甘露聚糖酶在飼料業(yè)、食品業(yè)及植物膠降解等行業(yè)應(yīng)用較多（Li等，2020；Jeon等，2019），例如，在飼料業(yè)β-甘露聚糖酶可以將飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子甘露聚糖轉(zhuǎn)化為營(yíng)養(yǎng)性更高、功能性更強(qiáng)的甘露寡糖（Liu等，2021），提高飼料的營(yíng)養(yǎng)吸收率和飼喂效率（Seo等，2016）。利用其降解植物膠的功能可以水解甘露聚糖生產(chǎn)甘露寡糖，甘露聚糖在植物中主要存在于種子胚乳中用于儲(chǔ)存植物多糖，多來(lái)自于豆科植物瓜爾豆提取的瓜爾豆膠（康立新等，2012）、南星科植物魔芋提取的魔芋膠（李小菊等，2013）以及豆科植物刺槐提取的刺槐豆膠等（謝靜靜，2013）。目前工業(yè)上甘露寡糖的制備主要是通過(guò)甘露聚糖酶解法進(jìn)行（Zhang等，2021），不同來(lái)源的甘露寡糖在結(jié)構(gòu)和組成上有所不同，主要與β-甘露聚糖酶的來(lái)源及所用底物單糖組成有關(guān)。在飼料業(yè)甘露寡糖能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道的消化吸收，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡（Giannenas等，2016），減少有害菌在腸道的定植和生長(zhǎng)，維持有益菌的動(dòng)態(tài)平衡（Chao等，2019）。此外，甘露寡糖還能提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，減少疾病的發(fā)生（吳峰洋等，2016）。通過(guò)分析國(guó)內(nèi)甘露寡糖生產(chǎn)狀況發(fā)現(xiàn)，工業(yè)利用酶解法制備甘露寡糖工藝尚不成熟，因此，發(fā)現(xiàn)新的β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶菌株并應(yīng)用于甘露寡糖的生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 試驗(yàn)樣品為在河南省濟(jì)源市豬場(chǎng)采集的新鮮仔豬糞便。

1.1.2 主要試驗(yàn)儀器 上海福瑪設(shè)備公司QYC2012C 控溫?fù)u床，美國(guó)Waters 公司三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，德國(guó)Biometra 公司Thermoblock PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Chamber KG-SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，美國(guó)Bio-Rad 公司Bio-Rad 分子成像儀，美國(guó)SORVALL RC 6PLUS 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)zeiss 公司熒光顯微鏡，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司DNP-9082 恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.3 試劑 魔芋膠、瓜爾豆膠、剛果紅、酵母粉、牛肉粉、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、氯化鎂、磷酸二氫鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭患?xì)菌DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；分子生物學(xué)試劑購(gòu)自華大基因公司；API 生理生化鑒定試劑盒購(gòu)自梅里埃生物公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g，pH 7.3，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min。

β-甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基：魔芋膠3 g、蛋白胨6 g、酵母粉1 g、氯化鈉0.5 g、剛果紅0.5 g、氯化鎂0.2 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂18 g，pH 6.0，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min。

β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基：魔芋膠15 g、硝酸鈉10 g、硫酸亞鐵1 g、氯化鈣1.5 g、氯化鈉1.5 g，pH 7.0，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 采集樣品前準(zhǔn)備無(wú)菌采樣容器，采集樣品時(shí)去除前部和尾部糞便，采集中部糞便樣品，采集后立刻放入無(wú)菌容器中。

1.2.2 菌種篩選純化 取河南濟(jì)源豬場(chǎng)未滿(mǎn)月新鮮仔豬糞便樣品，稱(chēng)取1 g 樣品用無(wú)菌水制成懸液，然后依次稀釋成10-4、10-5、10-6糞便稀釋液，分別吸取100 μL 涂布于β-甘露聚糖酶篩選平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察透明圈，選擇透明圈較為明顯的菌株，將產(chǎn)酶菌株挑出保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活力測(cè)定 將篩選得到的菌株接種于β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h 得到發(fā)酵酶液，而后在4 ℃、12000 r/min條件離心10 min，得到上清液即為β-甘露聚糖酶，參照GB/T 36861-2018 飼料添加劑β-甘露聚糖酶活力測(cè)定方法測(cè)定β-甘露聚糖酶活力。

1.2.4 外觀形態(tài)鑒定 對(duì)保存的產(chǎn)酶菌株挑取單菌落接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形態(tài)、外觀等，并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.5 生理生化鑒定 利用梅里埃API 鑒定試劑盒對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)目標(biāo)菌株的基因組進(jìn)行提取。而后進(jìn)行PCR，引物序列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反應(yīng)體系50μL：ddH2O21μL，1492R 1.5 μL、27F 1.5 μL，TaqMix 酶25 μL，樣菌模板DNA 1 μL。PCR 程序：94 ℃預(yù)變性4 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。而后將PCR 產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。將16S rDNA 序列在NCBI 官網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行同源性比較分析。

1.2.6 甘露寡糖的制備

1.2.6.1 底物的制備 反應(yīng)底物選擇魔芋膠和瓜爾豆膠兩種，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g 底物，加入800 mL pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液（GB/T 36861-2018），不斷攪拌并持續(xù)加熱，至底物溶解完全，用pH 5.5 的乙酸-乙酸鈉緩沖液定容為1 L，制成1%底物溶液。

1.2.6.2 粗酶液的制備 將篩選得到的菌株接種于β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h 得到發(fā)酵酶液，將發(fā)酵結(jié)束后，吸取發(fā)酵液在4 ℃、12000 r/min 條件下離心10 min，棄去沉淀，所得上清液即為β-甘露聚糖粗酶液。

1.2.6.3 甘露寡糖的制備 將酶液和底物溶液按照1：10 體積比混合，在50 ℃水浴反應(yīng)12 h，得到酶解粗產(chǎn)物。取1 mL 酶解粗產(chǎn)物在12000 r/min、4 ℃條件離心10 min，吸取上清，棄去沉淀，吸取上清液0.5 mL 加入0.5 mL 50%乙醇溶液混勻，在12000 r/min、4 ℃條件離心10 min，吸取上清，棄去沉淀，得到甘露寡糖溶液。

1.2.6.4 甘露寡糖產(chǎn)物分析 甘露寡糖的產(chǎn)物分析采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀對(duì)甘露寡糖成分進(jìn)行分析。電離模式：電噴霧電離正離子模式，毛細(xì)管電壓：3.0 Kv，錐孔電壓：15 V，源溫度：120 ℃，脫溶劑氣溫度：400 ℃，脫溶劑氣流速：560 L/h。上述步驟中得到的甘露寡糖溶液吸取0.5 mL 加入0.5 mL Milli-Q 超純水混勻備用上樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果 從河南濟(jì)源市豬場(chǎng)仔豬糞便中分離得到一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，編號(hào)WBT0011，將其接種于β-甘露聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，所產(chǎn)生的的透明圈如圖1A 所示。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈白色，邊緣不整齊，如圖1B 所示。革蘭氏染色為陽(yáng)性菌，如圖1C 所示。

圖1 菌株外觀形態(tài)

2.2 生理生化鑒定結(jié)果 利用梅里埃API 50CHB 和API ZYM 試劑盒及其他生理生化反應(yīng)對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1～ 表4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、熊果苷、七葉靈檸檬酸鐵、水楊苷、D-海藻糖作為碳源。不能分解淀粉、纖維素，甲基紅、VP 實(shí)驗(yàn)等結(jié)果為陽(yáng)性，硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原等結(jié)果為陰性。通過(guò)API ZYM 試劑盒測(cè)定目標(biāo)菌株產(chǎn)酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有堿性磷酸鹽酶、酯酶、類(lèi)脂酯酶、類(lèi)脂酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、苯酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-葡萄糖苷酶活性。

表1 API 50CHB 試劑盒測(cè)定碳源利用結(jié)果

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 對(duì)菌株WBT0011 提取基因組后，利用通用引物27F 和1492R 對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶如圖2 所示，擴(kuò)增片段大小為1485 bp。通過(guò)發(fā)育樹(shù)軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，如圖3 所示。通過(guò)PUBMED BLAST 網(wǎng)站分析并與模式菌株比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Bacillus safensis 同源性高達(dá)99.52%。結(jié)合該菌株的生理生化特征、分子生物學(xué)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，最終鑒定該菌為沙福芽孢桿菌。

圖2 PCR 產(chǎn)物電泳圖

圖3 沙福芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4 β-甘露聚糖酶活力測(cè)定 將篩選得到的菌株發(fā)酵以后取上清液，然后參照GB/T 36861-2018 飼料添加劑β-甘露聚糖酶活力測(cè)定方法測(cè)得β-甘露聚糖酶活力為3.8 U/mL。

表2 氮源利用結(jié)果

表3 生化特征

表4 API ZYM 酶活性反應(yīng)

2.5 甘露寡糖產(chǎn)物分析 對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析（圖4 和圖5），根據(jù)峰值的質(zhì)荷推測(cè)魔芋膠水解產(chǎn)物有二糖、三糖、六糖、七糖、十一糖，瓜爾豆膠降解產(chǎn)物有二糖、三糖、四糖、十糖，說(shuō)明二者水解效果較好，表明篩選得到沙福芽孢桿菌菌株所產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活性較好。

圖4 魔芋膠水解質(zhì)譜圖

圖5 瓜爾豆膠水解質(zhì)譜圖

3 討論

本研究從河南濟(jì)源豬場(chǎng)的仔豬新鮮糞便中分離得到一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶WBT0011，通過(guò)該菌株的生理生化特征、分子生物學(xué)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，最終鑒定該菌為沙福芽孢桿菌。在動(dòng)物日糧中添加β-甘露聚糖酶可以有效提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分表觀消化率（薛瑞婷等，2020）。β-甘露聚糖酶能夠去除飼料中甘露聚糖類(lèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子，水解為對(duì)動(dòng)物機(jī)體更加有利、飼料中應(yīng)用更多的甘露寡糖（張建新等，2019）。在飼料中添加甘露寡糖能顯著提高動(dòng)物的抗氧化性能、生產(chǎn)性能，改善動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡（孫盛明等，2014）。目前利用魔芋膠、瓜爾豆膠等甘露聚糖等原料和β-甘露聚糖酶反應(yīng)制備甘露寡糖生產(chǎn)工藝還有待優(yōu)化提高，新發(fā)現(xiàn)的沙福芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶能夠有效水解魔芋膠和瓜爾豆膠生成二糖、三糖、四糖等多種寡糖，這與尹夢(mèng)雅（2014）的研究結(jié)果一致。

β-甘露聚糖酶在飼料業(yè)應(yīng)用廣泛，利用微生物方法制備甘露寡糖綠色環(huán)保，流程簡(jiǎn)單，甘露寡糖作為一種重要的飼料添加劑，在調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡，減少有害菌在腸道的定植和生長(zhǎng)方面表現(xiàn)良好。通過(guò)篩選從仔豬糞便中得到一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的沙福芽孢桿菌WBT0011，表現(xiàn)出較強(qiáng)β-甘露聚糖酶產(chǎn)酶活性，為以后進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)甘露寡糖提供參考。