超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定飼料中6 種多肽類抗生素

喬穎，袁奎敬，韓鳳麗，葛祥武，劉雪紅，黨媛媛

（大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧大連 116037）

多肽類抗生素（polypeptide antibiotics）是從多黏桿菌或產氣孢子桿菌的培養液中提取具有多肽結構特征的一類抗生素，常用類型包括桿菌肽、恩拉霉素、維吉尼亞霉素、那西肽等。多肽類抗生素可對抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、綠膿桿菌等的感染，廣泛應用于家禽、豬、牛等飼料和獸藥中，具有預防動物疾病、促進動物生長等作用（劉靜等，2019；錢卓真等，2016；呂惠序，2013；葉婷婷等，2011；孫興權等，2008；Daghighian等，1982）。近年來，隨著多肽類抗生素的廣泛使用，不合理使用問題時有發生，致使致病菌耐藥性問題日益嚴重（何夢如等，2020；吉艷艷，2019）。對此，農業農村部發布 《中華人民共和國農業農村部公告 第194 號》，明確要求自2020 年1 月1 日起，退出除中藥外所有的促生長類藥物飼料添加劑品種，這其中就包括多種多肽類抗生素。因此，針對禁抗品種，建立飼料中多種多肽類抗生素的檢測方法對于飼料監管意義重大。

目前關于多肽類抗生素的檢測方法主要有微生物法（王正彬等，2015；郭桂芳等，2014）、酶聯免疫吸附法（劉宏軍等，2013）、毛細管電色譜-激發誘導熒光法等（雷霄云等，2018）。微生物法是多肽類抗生素檢測應用比較早也比較廣泛的一種方法，但是存在靈敏度低、單次實驗耗時長等缺點。酶聯免疫吸附法專屬性不強，應用也比較受限。近年來，隨著液相色譜串聯質譜技術應用的日益廣泛，已有文獻報道采用液質聯用技術測定飼料中多肽類抗生素的檢測方法（聶貞等，2021；張艷等，2020；趙靜等，2020；杜鑫等，2018；曹文卿等，2015；曹文卿等，2012；黃永輝，2011），但這些方法大多檢測指標單一，且前處理比較繁瑣費時。為此，本研究擬采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定飼料中6 種多肽類抗生素，利用通過型PRiME HLB 固相萃取柱對樣品進行凈化，實現對飼料中多肽類抗生素的快速、準確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 桿菌肽（桿菌肽A 純度為47.1%、桿菌肽B 純度為28.9%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；恩拉霉素A（純度為97.3%）、恩拉霉素B（純度為89.2%），美國TOKU-E 公司；維吉尼亞霉素M1（純度為99.3%）、維吉尼亞霉素S1（純度為99.5%），以色列FERMENTEK 公司。乙腈、甲醇、甲酸（色譜純），美國Fisher 公司；鹽酸（分析純），天津科密歐試劑有限公司；Oasis HLB 固相萃取柱（3 mL，60 mg），美國Waters 公司；Oasis PRiME HLB 柱（3 mL，60 mg），美國Waters 公司；Captive EMR Lipid 凈化柱（6 mL，600 mg），美國安捷倫公司；實驗室用水為Milli-Q 超純水；0.22 μm GHP 濾膜，美國Waters 公司。

1.2 儀器與設備 Waters Xevo TQ-S 高效液相色譜-串聯質譜儀，美國Waters 公司；IKA MS3 混合漩渦儀，德國IKA 公司；CF16RX 型高速冷凍離心機，日本日立公司；KQ-250B 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q 去離子水發生器，美國Millipore 公司。

1.3 標準溶液的制備

1.3.1 標準儲備溶液 分別稱取恩拉霉素A 和B，維吉尼亞霉素M1和S1各標準品適量，用甲醇溶解并定容，配成質量濃度均為100 mg/L 的標準儲備液，于-20 ℃條件下貯存。

稱取桿菌肽標準品適量，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容，配成質量濃度為100 mg/L 的標準儲備液，于-20 ℃條件下貯存。

1.3.2 基質匹配混合標準系列工作液 取飼料空白樣品，按照1.4.3 樣品前處理方法進行提取凈化，得到空白基質溶液，根據實驗需要配成恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 質量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/L，維吉尼亞霉素M1和S1質量濃度為2.5、5、10、25、50、100 μg/L 的基質匹配混合標準系列工作液。

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：0.1%甲酸乙腈（A 相）-0.1%甲酸水溶液（B 相）；梯度洗脫程序：0～ 2.0 min，95%～ 70% B;2.0～ 4.0 min，70%～20%B;4.0～5.1 min，20%～95%B；7.5 min，95% B。

1.4.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子多反應監測（MRM）模式；離子源溫度：150 ℃；毛細管電壓：1.0 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1000 L/h。

1.4.3 樣品前處理 提取：稱取1 g 飼料樣品（準確至0.01 g）于50 mL 塑料離心管中，準確加入5 mL 0.1 mol/L 鹽酸水溶液/乙腈（3：7，V/V），渦旋1 min，超聲提取10 min，4 ℃下10000 r/min 離心5 min，上清液轉移至另一離心管中。再向殘渣中加入5 mL 提取液，重復以上提取操作，合并兩次上清液。

凈化：取上述上清液適量，注入Oasis PRiME HLB 固相萃取柱中，將濾液收集于10 mL 離心管中，用0.22 μm 濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS 儀測定。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化 實驗比較了使用甲醇和乙腈作為有機相時，6 種多肽類抗生素響應大小。實驗結果表明，采用乙腈作為有機相時，6 種多肽類抗生素的響應均較高，因此選擇乙腈作為流動相中的有機相部分。另外，由于采用正離子模式檢測，甲酸可以為陽離子的形成提供必要的質子來源，來提高質子化效率（Kaufmann等，2013），同時甲酸可以使色譜柱內的硅膠硅醇基質子化，從而減弱硅醇基與待測物的相互作用，減少色譜峰拖尾，使得色譜峰響應好峰形佳，因此最終選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。調整流動相梯度，使6 種多肽類抗生素實現較好的分離效果。優化后的色譜圖如圖1 所示。桿菌肽B有多個同分異構體，在本實驗條件下，桿菌肽B產生兩個無法分離的色譜峰，因此本實驗以桿菌肽B 總峰面積進行定量計算。

2.1.2 質譜條件的優化 6 種多肽類抗生素是由氨基酸縮合而成的肽類物質，分子質量較大，其分子質量在525～ 2369。在進入一級質譜后，易與一個或多個H+結合，產生帶正電的單電荷或多電荷離子（Song等，2018）。實驗中，向儀器中注入100 μg/L 的6 種待測物混標，在正離子條件下進行全掃描，維吉尼亞霉素M1和S1在一級質譜中能產生豐度較大的[M+H]+準分子離子峰；桿菌肽A 和B、恩拉霉素A 和B 在進入一級質譜后能產生不同豐度的雙電荷離子和三電荷離子，通過實驗觀察，三電荷離子（[M+3H]3+）的離子豐度明顯大于雙電荷離子（[M+2H]2+），因此對于以上4 種多肽類抗生素采用[M+3H]3+作為準分子離子峰。通過比較母離子的信號強度來優化錐孔電壓，比較子離子的信號強度來優化碰撞能，優化后的質譜采集參數如表1 所示。

表1 6 種多肽類抗生素的分子質量和質譜采集參數

2.2 前處理方法的優化

2.2.1 提取試劑的選擇 根據各類多肽類抗生素溶解性的不同：桿菌肽類易溶于水，且在弱酸性條件下比較穩定，恩拉霉素易溶于鹽酸，維吉尼亞霉素易溶于乙腈等有機溶劑（Wu等，2020；Boison等，2015）。同時結合文獻中報道的相應提取試劑，本方法擬采用0.1 mol/L 鹽酸水溶液-乙腈作為提取試劑，并對水相和有機相的體積比進行了優化。實驗中比較了體積比分別為5：5，3：7，2：8 三種比例提取試劑的提取效果，以飼料樣品中添加0.5 mg/kg 待測物，各待測物的提取回收率為評價指標，結果見圖2。從圖2 中可以觀察到，當0.1 mol/L 鹽酸水溶液與乙腈的體積比為5：5時，桿菌肽A 和B、維吉尼亞霉素M1和S1的提取回收率均低于體積比3：7，恩拉霉素A 和B 的提取回收率與體積比3：7 持平；當二者體積比為2：8時，6 種待測物的提取回收率均比體積比3：7 低。綜合考慮選擇0.1 mol/L 鹽酸水溶液與乙腈的體積比為3：7 的混合溶液作為最終提取液。

圖2 0.1 mol/L 鹽酸水溶液與乙腈的不同體積比對6 種多肽類抗生素提取回收率的影響（n=3）

2.2.2 凈化方法的選擇 飼料產品種類繁多，基質復雜，因此必須要對樣品的提取液進行凈化處理，以減少雜質對待測物的干擾，并降低基質效應的影響。實驗比較了采用HLB 固相萃取柱、Captive EMR Lipid 凈化柱以及通過型PRiME HLB 固相萃取柱的凈化效果。實驗結果表明，采用HLB 固相萃取柱時，需要經過活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，而且上柱液過柱緩慢，凈化耗時較長，凈化后待測物回收率較低，其中恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 的回收率均小于30%；采用Captive EMR Lipid 凈化柱時，凈化后溶液較渾濁，基質效應對前端出峰的恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 的影響較大；采用通過型PRiME HLB 固相萃取柱時，待凈化液可實現一步凈化，操作簡單，凈化后溶液澄清，樣品回收率均大于80%。

2.3 方法學驗證

2.3.1 基質效應和線性 基質效應是液相色譜-串聯質譜聯用ESI 接口最常見的問題。實驗通過比較6 種多肽類抗生素在超高效液相色譜串聯質譜儀上的相對響應值（基質匹配標液響應值/純標液響應值）來評價基質效應（肖志明等，2021）。恩拉霉素A 和B 的相對響應值分別為70.8%、72.4%，桿菌肽A 和B 的相對響應值分別為69.3%、64.4%、維吉尼亞霉素M1和S1的相對響應值分別為124%、116%，表明恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 存在基質抑制現象，維吉尼亞霉素M1和S1存在基質增強現象。因此，本研究擬采用基質匹配標準曲線進行定量分析。

將基質混合標準系列工作液上機進行測定，以質量濃度（X，μg/L）為橫坐標，定量MRM 離子對的峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程如表2 所示。結果表明，恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 在質量濃度為5～ 200 μg/L 內線性關系良好，維吉尼亞霉素M1和S1在質量濃度為2.5～ 100 μg/L 內線性關系良好，相關系數（r2）為0.9985～ 0.9991。

2.3.2 方法定量限 方法的定量限（LOQ）是指在獲得滿意的回收率和標準偏差的前提下，在樣品中可以檢測到目標化合物的最低濃度（喬穎等，2021）。本方法中恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B的定量限可實現0.05 mg/kg，維吉尼亞霉素M1和S1的定量限可實現0.025 mg/kg，在該水平下的平均添加回收率為83.2%～ 102.6%，相對標準偏差均低于7.8%，表明該定量限滿足方法學驗證要求。

2.3.3 回收率和精密度 取空白飼料樣品，設置2 倍、5 倍、20 倍LOQ 的3 個添加水平，每個水平6 個平行，按照1.4.3 中樣品的前處理方法測定，進行方法的回收率和精密度實驗。結果如表2 所示，6 種多肽類抗生素的平均回收率為83.2%～112.1%，相對標準偏差均小于5.3%。結果表明該方法的準確度和精密度均良好，適用于飼料中6種多肽類抗生素的檢測。

表2 6 種多肽類抗生素的回收率、精密度、線性范圍、線性回歸方程及相關系數

2.4 實際樣品的檢測 為了驗證方法的可靠性，應用研究中建立的方法，對隨機抽取的50 批次飼料樣品中的6 種多肽類抗生素進行檢測，飼料品種包括濃縮飼料、配合飼料、預混合飼料、自配料等。其中，在1 份樣品中檢出桿菌肽，含量（以桿菌肽A 和B 總和計）為6.2 mg/kg。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定飼料中6 種多肽類抗生素的檢測方法，以0.1 mol/L 鹽酸水溶液/乙腈（3：7，V/V）作為提取液，經通過型PRiME HLB 固相萃取柱凈化，可實現對樣品的一步式凈化，極大地節約了前處理時間，可以有效地去除樣品中復雜基質干擾，提高待測組分的回收率。恩拉霉素A 和B、桿菌肽A 和B 在質量濃度為5～200 μg/L內，維吉尼亞霉素M1和S1在質量濃度為2.5～ 100 μg/L 內線性關系良好。6種多肽類抗生素在添加濃度0.025～1.0 mg/kg內，平均回收率為83.2%～112.1%，相對標準偏差小于7.8%，準確度、精密度均滿足方法要求。本方法操作簡便，測定結果穩定可靠，適用于飼料中多肽類抗生素的定性篩查和定量檢測，可為我國的飼料禁抗行動提供有力的技術支持。