一株喜油嗜熱芽孢桿菌G1201 產高溫蛋白酶的性質研究及異源表達初探

朱 檬，劉國瑞 ，張軍 ，湯偉，2，孫曉雯，唐濤，2，趙麗紅，何增國

（1.中國海洋大學醫藥學院，山東青島 266000；2.青島海洋生物醫藥研究院，山東青島 266000；3.青島百奧安泰生物科技有限公司，山東青島 266000）

蛋白酶是一種重要的酶制劑，在飼料、食品、醫藥等領域有著廣泛的應用（Goutam 和Arun，2017）。有統計顯示，在酶制劑市場份額中蛋白酶占比超過65%（Garg等，2016）。隨著人們對產品品質追求的提高和生產分工的細化，普通蛋白酶逐漸無法滿足如飼料制粒、食品烘焙中的高溫過程，這些行業對高溫蛋白酶提出了迫切需求。

微生物以其來源廣泛、培養周期短、便于工程化操作成為目前蛋白酶最主要的來源（于建榮等，2015；鄧菊云，2008；張燕新等，2007）。更重要的是許多極端自然環境中，如火山口、海底熱液區、熱泉等天然存在許多耐熱的微生物菌種，其中必然孕育了高溫蛋白酶的基因資源。對其中微生物種質資源的發掘，可為高溫蛋白酶的開發提供篩選基礎。已有研究報道，從這些環境中篩選得到了具有良好應用前景的高溫蛋白酶（桑鵬等，2019；桑鵬等，2019；陳逍遙，2015；Mashayekhi等，2012）。

目前已報道產高溫蛋白酶的菌屬有芽孢桿菌屬、熱球菌屬、硫化葉菌、火球菌屬等（曾靜，2014；呂明生等，2011；聞真珍，2010；黃光榮等，2007）。Geobacillus 屬是2001 年被命名的一個耐熱菌屬，該屬微生物來源廣泛，具有良好的耐熱性（Nazina等，2001）。已有一些從該屬微生物中分離得到高溫蛋白酶的報道（Goutam 和Arun，2017；廖艷江，2010；Chen等，2004；Nazina，2001）。本文從長期處于高溫的燒烤環境中分離得到1 株喜油嗜熱芽孢桿菌（Geobacillus thermoleovorans），發現其產高溫蛋白酶的功能，并對其產高溫蛋白酶進行了表征和酶學性質研究。同時，本文通過基因工程菌手段，嘗試對該高溫蛋白酶進行異源表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 T4 DNA Ligase、膠回收試劑盒、IPTG 和硫酸卡那霉素購自上海生工生物工程有限公司；限制性內切酶（EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ）購自大連寶生物有限公司；基因組提取試劑盒、質粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；酪氨酸、福林酚購自Sigma；其余非特殊注明試劑均購自國藥化學試劑有限公司。

菌株與質粒：大腸桿菌BL21（DE3）和質粒pET-28a（+）由中國海洋大學海洋生命學院惠贈。

1.1.2 培養基及緩沖溶液、試劑 脫脂奶粉篩選培養基參照Thebti（2016）方法并做出改良：脫脂奶粉20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水至1 L，115 ℃，滅菌20 min。

酪蛋白標準溶液：稱取0.500 g 酪蛋白，用少量0.5 moL 的NaOH 溶液潤濕，然后加入緩沖液大約40 mL，沸水浴30 min，期間攪拌至完全溶解，冷卻后定容至50 mL。

1.1.3 樣品來源 土壤樣品采集自中國海洋大學浮山校區附近（36.075422°N，120.437054°E）蒸汽排氣口下含油土樣。

1.2 方法

1.2.1 產高溫蛋白酶菌株篩選及理化特征鑒定取采集土樣25 g 加入到225 mL 無菌水中，180 r/min搖培30 min，制成樣品懸液。取1 mL 樣品懸液加入到9 mL 無菌水中進行10 倍梯度稀釋。選取合適的稀釋梯度，取100 μL 涂布于脫脂奶粉培養基上，65 ℃培養24 h。觀察比較水解圈直徑與菌落直徑比值，選取比值最大的進行液體復篩，70 ℃下測量發酵液酶活，篩選出酶活最高的菌株，編號G1201。對篩選得到的菌株在LB 固體培養基上進行連續3 次劃線分純，甘油管保藏純化出的單菌落以待進一步研究。

參照《常見細菌系統鑒定手冊》對G1201 進行厭氧性、運行性、觸酶等生理性質鑒定，并利用O’Meara 法進行V-P 實驗鑒定其生化特征。同時，進行革蘭氏染色，并用透射電鏡（TEM）觀察G1201 的菌體形態特征。

1.2.2 16S rRNA 基因序列分析及系統發育構建采用基因組提取試劑盒提取G1201 基因組DNA。以此為模板，采用通用引物 27 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492 R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）擴 增G1201 的16S rRNA 基因序列。PCR 反應條件（張軍，2110），95 ℃55 min；94 ℃0.5 min，55～ 60 ℃0.5 min，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃10 min。PCR 產物送上海生工測序。測序結果在GeneBank 中進行Blast N 比對，用MEGA7.0 軟件，采用Neighbor-Joining 法構建系統發育樹，進化樹分支采用Bootstrap 法并重復1000 次。

1.2.3 粗酶的制備及酶活測定 將G1201 菌株接入LB 培養基中，65 ℃，180 r/min 培養16 h，離心取上清液。在4 ℃條件下，分別用30%、40%、50%、60%、70%和80%硫酸銨對發酵上清液逐級沉淀過夜。之后，4 ℃，10000 r/min 離心30 min，收集沉淀物，將沉淀分別溶于相同體積的PBS（pH 7.5）中測定酶活，以酶活最大的硫酸銨沉淀物為粗酶，進行酶學性質分析。

酶活力單位定義為：在70 ℃條件下，每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸，定義為一個酶活力單位，以U/mL 表示。酪氨酸標準曲線繪制及酶活測定參照國標GB/T23527-2009（中國國家標準化管理委員會，2009），酶反應溫度設為70 ℃。

1.2.4 粗酶的酶學性質分析 粗酶溶于PBS中，進行最適催化溫度和溫度耐受性測定。將粗酶液與酪蛋白溶液在30～ 100 ℃條件下反應后，于堿性環境中與福林酚溶液進行顯色反應，在680 nm處測量其吸光度，確定最適酶催化溫度。溫度耐受性測定時，將粗酶液放置30～ 100 ℃下水浴孵育1 h后，在最適溫度70 ℃下與酪蛋白反應，測定不同溫度處理后，對酶活的影響。

粗酶和酪蛋白分別溶于不同pH（pH 4.0～12.0）的緩沖液中，制成粗酶液和酪蛋白標準溶液，在70 ℃下反應，通過測定不同pH 條件下粗酶液與酪蛋白反應的酶活，確定最適催化pH。pH耐受性測定，將不同pH 緩沖液溶解的粗酶液水浴孵育1 h，在70 ℃，pH 9.0 條件下測定酶活，確定其pH 耐受性。

粗酶溶于pH 9.0 的緩沖液，分別加入終濃度5 mmol/L 的Ca2+、Mg2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+和Na+，水浴孵育1 h，在70 ℃，pH 9.0 條件下測定酶活，探究不同金屬離子對酶活的影響。

在上述粗酶液中分別添加1%的表面活性劑（SDS、吐溫20、吐溫80 和曲拉通X-100）和終濃度5 mmol/L 的蛋白酶抑制劑[DTNB（2-硝基苯甲酸）、PMSF（苯甲基磺酰氟）和EDTA（乙二胺四乙酸）。水浴孵育1 h后，在70 ℃，pH 9.0 條件下測定酶活，分析表面活性劑和蛋白酶抑制劑對酶活的影響。

1.2.5 高溫蛋白酶的異源表達及分離純化

1.2.5.1 G1201 蛋白基因克隆與表達載體構建以NCBI 數據庫中Geobacillus 屬微生物編碼絲氨酸蛋白酶基因（ser）的序列為基礎，使用DNAMAN軟件進行多重序列比對，用Primer 5 軟件在ser 基因保守區設計上下游引物FE（5'-CGGAATTCATGTTTGGC TATTCAATAGTGCAGTTAGCCC-3'）和RX（5'-CGCTCGAGCTAGCGCTGCAGCAGTTGCT CAAT-3'），下劃線分別為EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位點。以G1201 的基因組DNA 為模板，擴增ser 的基因序列，之后分別用限制性內切酶EcoRⅠ和Xho Ⅰ對擴增片段和質粒載體pET-28a 雙酶切。T4 連接酶連接過夜后，熱激轉化大腸桿菌BL21（DE3）中，用含有硫酸卡納霉素（終濃度50 μg/mL）的平板、菌落PCR 和質粒單雙酶切篩選陽性轉化子并送上海生工測序。

1.2.5.2 重組蛋白誘導表達及分離純化 挑取BL21-pET-28a-ser 單菌落于含50 μg/mL 硫酸卡那霉素的LB 培養基中，37 ℃，180 r/min 培養3 h，至OD600到0.4～ 0.6。之后，加入IPTG（終濃度0.4 mmol/L）誘導表達4 h。4 ℃，8000 r/min 離心10 min 收集菌體，用PBS 洗滌2 次。離心后，加破碎緩沖液重新懸浮菌體進行超聲破壁（功率750 W）。超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀，進行SDS-PAGE 檢測，發現目的條帶以包涵體的形式存在于沉淀中。用8 mol/L 尿素溶解包涵體蛋白，低溫攪拌洗滌30 min。4 ℃，12000 r/min 離心20 min，取上清過Ni 柱純化目的蛋白并用蛋白測試試劑盒測定純化蛋白酶的含量。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 產高溫蛋白酶菌株篩選結果 通過在脫脂奶粉篩選培養基上對樣品初篩，在65 ℃培養條件下得到14 株產生透明圈的菌株，挑選透明圈直徑和菌落直徑比值最大的菌株（圖1a），進行液體復篩，篩選出酶活最高的菌株，編號G1201。在LB平板上70 ℃下培養24 h后，G1201 菌落直徑約3～ 4 mm，呈微黃色、半透明、邊緣不規則。該菌株革蘭氏染色呈陰性，通過透射電鏡觀察，該菌株呈桿狀，長3.0～ 3.5 μm，寬0.8～ 1.2 μm，端生孢子，有鞭毛（圖1b）。

圖1 菌株G1201 水解圈（a）和菌株G1201 電鏡圖（b）

通過厭氧性、運行性、觸酶試驗等生理生化性質鑒定，G1201 菌株的理化性質如表1 所示。參照《BERGEY’S MANUAL of Systematic Bacteriology Second Edition》（Paul等，2009）所述，確定該菌株與G.thermoleovorans 的理化性質一致。

表1 G1201 的生理生化特征

2.1.2 16S rRNA 基因序列鑒定 通過對G1201的16S rRNA 基因序列擴增后測序，其16S rDNA序列長度為1449 bp，將測得的序列上傳至Gen-Bank 數據庫（登錄號MK208514.1），對16S rRNA基因序列構建系統發育樹，結果顯示該菌株與G.thermoleovorans 的相似性為99%（圖2）。結合電鏡觀察及生理生化試驗，確定該菌株為G.thermoleovorans。

圖2 菌株G1201 和相似菌株的系統發育進化樹

2.2 粗酶的制備及粗酶學性質的研究

2.2.1 粗酶的制備 參照GB/T23527-2009 建立的酪氨酸標準曲線為Y=0.0099X+0.0111，其R2值為0.9998。以該標曲計算不同硫酸銨沉淀后的酶活，沉淀經PBS（pH 7.5）復溶后，通過福林酚法測定其不同濃度的硫酸銨沉淀物的酶活，發現60%硫酸銨沉淀物復溶后酶活最高。因此以60%硫酸銨下的沉淀物作為粗酶。

2.2.2 粗酶酶學性質 通過測定不同溫度下粗酶液的酶活，確定最適催化溫度為70 ℃，酶活達16.82 U/mL（圖3a）。溫度耐受性結果顯示，以70℃下測定的酶活為100%，30～ 60 ℃時酶活不變，80 ℃以上酶活有所降低，至100 ℃酶活仍能保持在50%以上（圖3b）。

圖3 溫度對酶活力和穩定性的影響

通過測定不同pH 條件下粗酶液的酶活，確定其最適pH 為9.0（圖4a）。pH 耐受性結果顯示，以pH 9.0 下測定的酶活為100%，該蛋白酶在堿性環境中耐受性很好，pH 8.0～ 12.0 下的酶活均能達到90%以上，在酸性環境中該酶的的耐受性較差，pH 4.0～7.0下，酶活只有26%～50%（圖4b）。

圖4 pH 對酶活力和穩定性的影響

粗酶液在含有不同金屬離子中孵育1 h后，以沒有添加金屬離子孵育的酶活視為100%，結果顯示Ca2+和Mg2+對酶活具有促進作用，其酶活分別達到131%和117%，Mn2+對酶活基本沒有影響，其他離子Co2+、Na+、Fe2+、Zn2+和Cu2+均對酶活力表現出有一定的抑制作用，抑制程度根據其蛋白酶殘余酶活判斷分別為46%、73%、75%、78%和93%（圖5a）。粗酶液在含有不同有機溶劑中孵育1 h 后測酶活，以沒有添加有機溶劑孵育的酶活視為100%，結果顯示吐溫20 和Triton X-100能夠促進酶活，其酶活分別達131%和115%，吐溫80 對酶活沒有影響，而SDS 表現出一定的抑制作用（圖6b）。而蛋白酶抑制劑DTNB、PMSF 和EDTA 表現出對酶活較強的抑制作用，其殘余酶活分別為5%、60%、28%（圖5b）。

圖5 金屬離子及表面活性劑和抑制劑對酶活力和穩定性的影響

2.1.5 G1201 蛋白基因的克隆與表達載體的構建通過對克隆基因PCR 產物測序，其基因長度為1434 bp，將核酸序列上傳至國家微生物科學數據中心（NMDC），基因編號：NMDCN0000Q22。在MDAMAN 軟件中翻譯該基因序列，得到其編碼蛋白酶序列（圖6）。在Genebank 數據庫對克隆基因序列和翻譯后的蛋白序列進行Blast，結果顯示其為編碼ser 蛋白酶的基因，屬于屬于絲氨酸蛋白酶家族，且存在該蛋白酶家族保守的氨基酸基序GTSMATP。在ExPasy 網站中用ProtParam tool，分析其序列特征，結果預測顯示該蛋白穩定指數小于40為穩定蛋白，總平均親水性為負值表明該蛋白為親水性蛋白（表2）。將克隆的目的基因連接到質粒載體pET-28a上，通過雙酶切驗證（圖7），成功構建了目的基因的重組質粒載體pET-28a（+）-ser。

圖6 核酸序列和編碼蛋白序列

表2 蛋白理化性質預測

圖7 重組質粒酶切

2.3.2 重組蛋白的表達及鑒定 提取重組質粒載體pET-28a（+）-ser 轉入表達菌株大腸桿菌BL21（DE3）中，構建表達該蛋白酶的基因工程菌BL21（DE3）-pET-28a（+）-ser。以IPTG 為誘導物誘導目的基因表達，結果顯示在誘導4 h 的發酵液中約50 kD 處出現了目的條帶（圖8）。

圖8 蛋白酶誘導表達電泳圖

2.3.3 重組蛋白酶的純化 菌體破壁后電泳結果顯示，目的蛋白以包涵體的形式存在于沉淀中，用8 mol/L 尿素對包涵體進行復性。之后，通過Ni 柱進行純化，得到了目的蛋白（圖9）。通過BCA 法測得的純化后蛋白質濃度為0.108 mg/mL。

圖9 目的蛋白的純化電泳圖

3 討論

耐高溫蛋白酶可適應高溫加工環境，在飼料制粒、食品烘焙、高溫洗滌等行業有重要的應用，一直以來都是研究的熱點（Manavalan等，2020；Niu等，2017；Dadshahi等，2016；Charbonneau等，2012）。Geobacillus屬的微生物作為2001年從Bacillus屬分離出的嗜熱菌群，其中蘊含了豐富的耐高溫蛋白酶資源。目前，眾多國內外的學者從該屬微生物中分離得到了耐高溫蛋白酶，如：Geobacillus.caldoproteolyticus（Chen等，2004），Geobacillus.subterraneus（Nazina，2001），Geobacillus.uzenensis（Nazina等，2001），Geobacillus.thermodenitrificans（Charbonneau等，2012）。本研究從蒸汽排氣口土樣中分離出的菌株G1201 能夠產耐高溫蛋白酶，經鑒定為G.thermoleovorans。比較值得注意的是，Geobacillus 屬及近源的Bacillus屬微生物革蘭氏染色表現為陽性，而本研究中的G.thermoleovorans G1201 革蘭氏染色表現為陰性。這 與 《BERGEY’S MANUAL of Systematic Bacteriology Second Edition》中對該種微生物的表述一致，G.thermoleovorans 種菌株革蘭氏染色陰性和陽性結果均有發現（Bose等，2016；Paul等，2009）。推測，G.thermoleovorans 在細胞壁的進化中可能扮演了關鍵性角色。研究顯示與G.thermoleovorans 近源的超嗜熱古菌（Hyperthermophilic archaea）均為革蘭氏陰性菌，兩者在進化上逐漸分離，但可能保留了相同的細胞壁構成（Teuku等，2019）。

目前，對G.thermoleovorans 產高溫淀粉酶（Mok等，2013）和高溫脂肪酶（Abol Fotouh等，2016）有較多的研究，而對其產高溫蛋白酶則鮮有報道（Teuku等，2019）。研究顯示，Geobacillus 屬菌株所產高溫蛋白酶的適宜溫度為55～ 90 ℃，適宜pH 為6～ 9（Baykara等，2021；Suleiman等，2020；Teuku等，2019；Charbonneau等，2012；Chen等，2004；Nazina，2001）。本研究中經60%硫酸銨沉淀的粗酶，最適溫度為70 ℃，最適pH 為9.0，于上述結果類似。耐受性試驗結果顯示，該酶表現出較強的高溫耐受性，在90 ℃以下均能達到酶活的80%以上，溫度達到100 ℃時仍能維持50% 的酶活。同時，該蛋白酶在pH 8.0～ 12.0 的酶活均能達到90%以上，表明該酶在中性及偏堿性條件下具有良好的催化能力。與同種微生物產生的高溫蛋白酶相比，G1201 所產蛋白酶具有更高的溫度耐受性和pH 適應性（Teuku等，2019）。

Ca2+、Mg2+、吐溫20 和Triton X-100 能夠促進酶活，而Co2+、Na+、Fe2+、Zn2+、Cu2+以及SDS、DTNB、PMSF 和EDTA 則可以不同程度的抑制酶活。對溫度和pH、金屬離子、表面活性劑和蛋白酶抑制劑的耐受性分析表明，該酶能夠耐受飼料制粒、食品烘焙和高溫洗滌過程中面臨的高溫環境，具有良好的應用潛能。

結合該蛋白酶偏堿性的pH 適應性，以及酶活受Ca2+、Mg2+的促進作用。同時，具有絲氨酸蛋白酶家族的保守基因序列：GTSMATP（Laskar等，2011）。因此，可將該高溫蛋白酶歸為絲氨酸蛋白酶家族。克隆全長為1434 bp 的該高溫蛋白酶基因構建大腸桿菌的表達載體pET-28a（+）-ser，在大腸桿菌BL21（DE3）中進行異源表達，結果顯示52.5 kD 的目的蛋白以包涵體的形式存在。包涵體是大腸桿菌表達體系中常見形式，對目的蛋白的純化和酶活具有較大影響。近年來，通過控制細菌熱休克反應來改善重組蛋白的折疊，從而避免包涵體的形成已經有一些研究進展（Overton，2014）。將來，可通過該手段改善G.thermoleovorans 源高溫蛋白酶異源表達過程中包涵體形成。