CD68巨噬細胞浸潤對原發性食管小細胞癌預后的影響

張玉鈴，劉迪填，陳春發

(1.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院醫療質量管理科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院胸部外科，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院乳腺中心，廣東 汕頭 515041)

食管癌是惡性實體腫瘤之一，在所有癌癥中其發病率居第7 位，死亡率居第6 位。原發性食管小細胞癌(primary esophageal small cell carcinoma，PESC)是最為常見的肺外小細胞癌。根據2019年世界衛生組織的分類，PESC 是神經內分泌癌一種亞型[1]，是一種少見的侵襲性惡性疾病。1952 年，McKeown 等[2]首次報道了PESC，主要發生在食管中下節段，約占我國所有食管腫瘤的0.36%～2.81%[3]，其臨床表現與食管鱗癌及腺癌相似。但與鱗癌、腺癌相比，其生長更快、侵襲性更強，早期便可出現淋巴結轉移和血行轉移，因此預后也更差。由于其罕見性和缺乏前瞻性研究，目前尚缺乏標準的治療方案和預后標記物。

越來越多的研究顯示，巨噬細胞在不同腫瘤微環境的刺激下發生的活化性質不盡相同，其表達的表型及各自發揮的功能也不相同，使得腫瘤患者出現不同的疾病發展和轉歸。對于這些浸潤在腫瘤中的巨噬細胞，我們將其統稱為腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociated macrophages，TAMs)。目前認為浸潤在腫瘤中的巨噬細胞按不同的活化狀態主要分為2 種類型：①M1型，又稱經典活化的巨噬細胞，具有抑制和殺傷腫瘤細胞的作用；②M2型，又稱替代性活化的巨噬細胞，可以促進腫瘤細胞的浸潤和轉移，進而促進腫瘤疾病的進展[4-5]。TAMs與PESC臨床病理指標的相關性尚缺乏充分的研究，近來研究表明，CD68是一種可用于標記M1、M2 型巨噬細胞的標志物，而CD163 是一種可特異性識別M2 型巨噬細胞的標志物[6-7]。因此本研究采用CD68 與CD163 分別標記巨噬細胞，嘗試了解M1及M2型TAMs在PESC中的浸潤情況，并分析其與PESC的臨床病理指標及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床病例及標本

收集汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院2000年1月—2019 年12 月有完整臨床病理資料的PESC 患者手術切除組織標本。該研究已獲得汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院醫療技術醫學倫理審查委員會的審查批準通過(批準文號2019030)?；颊呋蚱浼覍偻鈪⑴c該研究并簽署知情同意書。所有患者在手術前均未接受任何治療，首次治療為食管部分切除并頸內食管胃吻合術及區域淋巴結清掃，術后分期根據美國癌癥聯合會2017年第8 版TNM 分期標準進行[8]。本研究共收集標本69例，其中男性49例，女性20例，年齡44～76歲，中位年齡61歲。

1.2 主要抗體和試劑

鼠抗人CD68 及CD163 單克隆抗體，DAB 顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術公司產品。

1.3 免疫組織化學染色及結果判定

免疫組化EnVision 二步法操作步驟參照試劑盒說明書進行。CD68陽性巨噬細胞以細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為標記，CD163 陽性巨噬細胞則以細胞膜或細胞質呈現黃褐色或棕褐色顆粒為標記。計數CD68和CD163 巨噬細胞數量的方法參考本課題組已發論文[9]，在低倍鏡(×100)下觀察整張切片，選取陽性細胞最密集區，利用LEICA數字圖像采集系統于高倍視野(×400)下選取5～10 個陽性細胞最密集部位拍照，計算每張不重疊照片內陽性細胞數并取平均值代表該例標本瘤內浸潤巨噬細胞計數值，選擇中位數為高、低浸潤分組的截斷點[10-11]。

1.4 隨 訪

從患者術后出院起開始隨訪，主要采用門診及電話隨訪，隨訪截止時間為2021 年12 月或死亡，生存時間從患者手術之日起至最后隨訪時間或死亡時間，死亡不包括意外死亡者。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26統計學軟件進行統計分析，CD68和CD163 巨噬細胞浸潤情況與患者臨床病理指標關系的分析采用卡方檢驗和Fisher 精確檢驗，Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox 回歸分析各變量與預后的關系，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PESC組織中CD68、CD163巨噬細胞浸潤情況

免疫組化染色顯示CD68 及CD163 為胞質或胞膜染色，在腫瘤組織中可見胞質中出現明顯棕黃色或棕褐色顆粒的細胞浸潤，這部分細胞就是TAMs(圖1)。PESC 組織中CD68、CD163 巨噬細胞浸潤密度平均每個視野為(16.1±7.9)個和(10.5±5.1)個，中位數分別為15.0 個 和9.3 個。CD68 高 浸潤組36 例(52.2%，36/69)，CD163高浸潤組織占35例(50.7%，35/69)。

圖1 食管小細胞癌組織中CD68和CD163巨噬細胞的浸潤情況(IHC，×400)

2.2 CD68、CD163巨噬細胞浸潤情況與PESC臨床病理指標的關系

如表1所示，CD68巨噬細胞除了與腫瘤T分期有關(χ2=6.336，P=0.012)外，與其他臨床病理指標均無統計學相關。T1-T2 分期的PESC 患者中CD68 巨噬細胞高浸潤情況更常見。而CD163巨噬細胞與各臨床病例指標均無統計學相關。

表1 CD68、CD163巨噬細胞與食管小細胞癌臨床病理指標的關系

2.3 PESC總體生存情況及影響因素分析

69 例患者生存時間為2～209 個月，中位生存時間21個月。按不同臨床病理指標分類的患者中位生存期和總生存期如表2 所示，其中pTNM 分期、手術淋巴結清掃數目、N分期、輔助性化療、CD68巨噬細胞浸潤情況對中位生存期均有影響(組間差異均有統計學意義，P<0.05)。其中，PESC原發灶中CD68巨噬細胞高浸潤的患者預后更好(圖2)。

表2 食管小細胞癌患者生存分析

圖2 食管小細胞癌組織中CD68和CD163巨噬細胞浸潤的生存分析

2.4 PESC患者預后的多因素分析

將表2 中Kaplan-Meier 生存分析中具有統計學意義的指標pTNM 分期、手術淋巴結清掃數目、N 分期、輔助性化療、CD68巨噬細胞等參數分別納入多因素Cox 回歸分析，結果發現pTNM 分期、手術淋巴結清掃數目、CD68 巨噬細胞浸潤是PESC 患者獨立的預后影響因素(表3)。CD68 巨噬細胞的浸潤程度與患者的預后顯著相關[風險比=0.340，95%置信區間(0.179，0.645)，P=0.001]，CD68巨噬細胞高浸潤組的患者死亡風險降低約66%。

表3 PESC患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討論

在PESC 的發生發展過程中，腫瘤免疫微環境起著關鍵作用。其中，起源于外周血單核細胞的TAMs是腫瘤免疫微環境的重要組成部分。作為腫瘤微環境中的免疫調節細胞，TAMs 可極化成M1 或M2 表型，細胞表型的不同可導致不同的細胞因子分泌和功能的變化[12]。一般認為M1型TAMs 具有限制腫瘤生長的功能[13]，而M2型TAMs 更多的是與血管生成和腫瘤進展有關[14]。常用檢測TAMs 相關表面標志物包含CD68、CD206 和CD163 等等。目前缺乏標記M1 型巨噬細胞的特異性標記物，一般認為CD68可作為巨噬細胞M1型的標記物[15]。與常用于標記M1 型巨噬細胞的CD68相比，特異性標記CD163 檢測M2 型細胞對巨噬細胞具有更強的針對性，故CD163 可作為M2 型巨噬細胞高特異性標志物[16]。

本研究中，我們用CD68、CD163分別標記巨噬細胞，分析其與PESC 臨床病理指標間的關系，結果發現僅CD68巨噬細胞浸潤與腫瘤的T分期相關，T1-T2分期中的CD68 巨噬細胞浸潤密度更高。而CD68、CD163 巨噬細胞浸潤的情況和其他臨床病理指標均無統計學意義。在臨床上，惡性腫瘤的T 分期越早的患者往往具有更好的預后結果，這可能預示著高浸潤CD68 巨噬細胞的PESC 患者可能具有更好的生存結果。鑒于CD68 常常被作為M1 型巨噬細胞的標記物，我們推測以M1 型巨噬細胞為主的CD68 巨噬細胞浸潤，在早期PESC 抗腫瘤中起著重要作用。而CD163巨噬細胞與各病理指標間均無明顯相關，這點與以往其他惡性腫瘤的相關研究不符[17-18]。一方面可能與本實驗PESC 例數少有關，另一方面也有可能CD163 巨噬細胞在不同的惡性腫瘤所起的作用不一樣，需要擴充樣本量以及進一步的研究確認。

本研究的多因素Cox回歸分析結果顯示，pTNM分期、手術淋巴結清掃數目、CD68巨噬細胞表達是影響患者預后的獨立因素，CD68巨噬細胞浸潤密度高的患者生存期較長。這與之前報道的在前列腺、肺和腦腫瘤中的情況相符[19]。另外生存曲線顯示CD163 巨噬細胞高浸潤患者與低浸潤患者的預后差異無統計學意義，該結果與其他實性腫瘤如宮頸癌、食管鱗癌、乳腺癌等相左[11，20-21]，這可能與本實驗例數相對較少有關，也有可能與CD163巨噬細胞在不同類型的惡性腫瘤中的作用不一致有關。

雖然CD68是一種可用于標記M1、M2型巨噬細胞的標志物，但目前有研究支持CD68可作為M1型巨噬細胞的標記物[15，21]。結合本研究的結果，我們推測在PESC 組織中浸潤的CD68 巨噬細胞以具有抗腫瘤作用的M1 型巨噬細胞為主。當然，還需要尋找更具有特異性M1型巨噬細胞標記物的實驗進一步驗證。

在PESC 治療上尚缺乏前瞻性隨機對照臨床研究及治療規范，手術是PESC 局部控制的常用手段，而后續聯合化療可以進一步改善患者預后[22]。我們的研究結果也顯示術后接受化療的患者預后優于未化療的患者，最近的研究結果也支持化療明顯提高PESC 患者的生存[23]。另外，基于前面提到的M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞在腫瘤中作用的不同，是否可以通過調控TAMs表型轉化，使腫瘤組織中浸潤的M2型巨噬細胞向M1 型轉化，達到有效地抑制腫瘤細胞增殖和發展而起到治療作用，這將會是一個很有意義的研究方向。

綜上所述，高浸潤的CD68巨噬細胞是PESC患者的獨立預后因子，CD68巨噬細胞高浸潤的患者預后明顯優于CD68巨噬細胞低浸潤的患者。