山羊莫拉菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

莊科勤 ， 董文龍 ， 沙萬里 ， 徐菁岐 ， 盧殿杰 ， 孟雨晴 ， 高學勇 ， 付連軍

(1.吉林農業科技學院動物科技學院 ， 吉林 吉林 132109 ； 2.吉林市豐滿區動物疫病預防控制中心 ， 吉林 吉林 132013)

近年來，關于莫拉菌在臨床上的致病報道日益增多，該菌多寄生在人體和哺乳動物的呼吸道，為條件性致病菌。當機體免疫力低下時，多數莫拉菌可單獨或與其他細菌共同引起疾病，尤其是在幼兒及老年中較為常見[1]。與人類疾病密切相關的莫拉菌中，卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)是兒童呼吸道感染的第3位常見致病菌，并會引發敗血癥、腦膜炎、肺炎、自發性腹膜炎等；腔隙莫拉菌(Moraxellalacunae)可引發結膜炎、慢性鼻竇炎、心內膜炎等；非液化莫拉菌(Moraxellanonliquefaciens)可引發角膜炎；奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)和亞特蘭大莫拉菌(Moraxellaatlantae)可導致敗血癥[2-8]。

有學者發現，山羊莫拉菌可與某些致病菌共同作用引起山羊紅眼病[9]。此外，國外曾有兒童因感染該菌而導致心內膜炎發生的報道[10]。但就目前的資料來看，山羊莫拉菌的基本生物學特性、致病性和耐藥機制等尚不明確，因此，本試驗對其基本生物學特性進行探究，以期對將來的臨床防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病料和試驗動物 吉林市某養殖場的患病山羊，表現為精神沉郁、食欲減退、流黏性鼻液并伴有輕微咳嗽。昆明系4周齡SPF級小鼠20只，雌雄各半，體重為18～22 g。

1.2 培養基及試劑 BHI瓊脂培養基、MH瓊脂培養基、BHI肉湯培養基，均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；LB瓊脂培養基、細菌基因組DNA提取試劑盒、50×TAE緩沖液，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PremixTaq(ExTaqversion)，購自TaKaRa Bio；微量生化管、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；核酸染料、革蘭染色試劑，均購自北京索萊寶科技有限公司；凝膠回收試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。16S rDNA上、下游引物，由庫美生物科技有限公司合成。

1.3 細菌的分離培養 把采集的鼻拭子接種于BHI瓊脂培養基上，37 ℃培養18～24 h。將接種環徹底灼燒滅菌后，挑取單個菌落在LB瓊脂培養基上劃線，置于37 ℃恒溫箱中培養18～24 h，并將其命名為MC-1。

1.4 染色鏡檢 對載玻片用酒精消毒后，挑取單菌落用無菌生理鹽水稀釋，在酒精燈外焰加熱固定，按照革蘭染色說明書步驟進行染色，并于顯微鏡下觀察。

1.5 生化試驗 挑取純化培養后的MC-1接種于微量生化鑒定管，37 ℃培養20～24 h，試驗過程參照微量生化管說明書。

1.6 16S rDNA序列測定

1.6.1 基因組DNA的提取 取1.5 mL過夜培養菌液，嚴格按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取基因組DNA。

1.6.2 PCR擴增 PCR反應體系(25 μL)：PremixTaq酶12.5 μL，去離子水9.5 μL，模板MC-1基因組、上游引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，混合均勻。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.6.3 PCR測序 PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，其切膠純化產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7 系統進化分析 分離菌株MC-1的16S rDNA測序結果與GenBank數據庫中已知的不同種的細菌基因核酸進行BLAST比對分析，并參照相關菌株16S rDNA核酸序列構建系統進化樹。

1.8 藥敏試驗 選用獸醫臨床上常用的14種抗菌藥，采用紙片擴散法測定分離菌株MC-1的抑菌圈直徑，分析其藥物敏感性。

1.9 小鼠致病性試驗 將小鼠隨機分為4個組，每組5只，其中1個組作為對照組。取新鮮培養菌液，12 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體沉淀用PBS重懸，調整菌液濃度為1×109CFU/mL。試驗組小鼠腹腔注射重懸菌液0.2 mL/只，對照組腹腔注射相同劑量的PBS。接種后每隔6 h觀察1次，連續觀察5～7 d，期間觀察并記錄小鼠的精神狀態、體表變化和死亡情況。

2 結果

2.1 細菌的分離培養 將菌液接種于BHI瓊脂培養基上，37 ℃需氧培養36 h后進行觀察。發現該菌菌落較小，呈灰白色，菌落圓潤，表面光滑有凸起，見圖1。

圖1 MC-1菌落形態Fig.1 Colony morphology of MC-1

2.2 染色鏡檢 對挑取的單個菌落進行革蘭染色，在顯微鏡油鏡下觀察發現，菌株MC-1為革蘭陰性桿菌，在視野內多數排列緊密，常上下組合在一起，見圖2。

圖2 MC-1革蘭染色 (1 000×)Fig.2 Gram staining of MC-1 (1 000×)

2.3 生化試驗 記錄試驗結果并參照《伯杰細菌鑒定手冊》第8版進行分析。結果顯示，MC-1氧化酶陽性，符合莫拉菌的性質。但MC-1可以發酵葡萄糖和蔗糖，這點與其他莫拉菌存在不同，見表1。

表1 MC-1生化試驗結果Table 1 Results of MC-1 biochemical test

2.4 16S rDNA序列測定 分離菌株16S rDNA PCR擴增產物電泳結果顯示，其擴增產物在1 500 bp左右，見圖3。序列結果在GenBank數據庫中經BLAST分析，顯示該菌與莫拉菌的同源性為99.7%，證實分離菌株為莫拉菌。

圖3 分離株16S rDNA的PCR 擴增Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA gene from isolated strain M：DL2 000 DNA Marker； 1、2：MC-1 16S rDNA PCR擴增產物M:DL2 000 DNA Marker; 1,2:PCR product of MC-1 16S rDNA

2.5 系統進化分析 核苷酸測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST分析，與莫拉屬其他種的16S rDNA序列建立進化樹。結果顯示，該分離菌株與Moraxellacaprae(登錄號：NZ AUGF0100104.1)親緣關系極近，再次證明MC-1為山羊莫拉菌，見圖4。

圖4 MC-1與其他莫拉菌16S rDNA系統進化樹的構建Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene from MC-1 and other Morexella strains▲：本試驗獲得分離株▲：The isolates obtained in this test

2.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法對MC-1進行藥敏試驗，并測定抑菌圈直徑。分析藥敏試驗數據并參考相關研究，發現MC-1對試驗中的14種抗菌藥物均敏感，見表2。

表2 MC-1藥敏試驗結果Table 2 Results of MC-1 drug sensitivity test

2.7 小鼠致病性試驗 試驗組注射菌液約24 h后，部分小鼠出現精神沉郁、毛發蓬亂、打堆現象；48 h后隨機選取精神不佳小鼠剖檢，未發現典型病變癥狀；72 h內所有精神不佳小鼠恢復正常狀態，試驗階段小鼠均未死亡。

3 討論

本試驗在采集的山羊鼻拭子樣品中分離得到菌株MC-1，通過對其菌落及菌株的形態特征觀察，并結合生化試驗、16S rDNA序列測定和系統進化樹分析，鑒定菌株MC-1為山羊莫拉菌。山羊莫拉菌是Kodjo等在健康山羊的鼻腔中分離的類莫拉菌，在進行了全基因組DNA-DNA雜交、DNA堿基組成和遺傳轉化研究后，將其歸屬于莫拉菌屬[11]。莫拉菌屬為無動力的桿菌或球桿菌，氧化陽性酶，對糖類不發酵，生化反應不活潑。過去認為莫拉菌屬對人體無致病力，目前認為其對人體是機會致病菌，在機體防御功能不健全或免疫功能受到嚴重抑制時，其可單獨或與其他細菌共同感染，引起腦膜炎、敗血癥、心內膜炎和胸膿等[12]。多篇報道顯示，絕大多數莫拉菌對青霉素敏感，某些菌株對卡那霉素、青霉素、慶大霉素耐藥[13]。

本試驗中山羊莫拉菌菌株MC-1，通過小鼠致病試驗發現其毒力較弱。從基本生物學特性來看，菌株MC-1與同屬的其他莫拉菌存在明顯的差異。生化試驗中，傳統莫拉菌對糖類不發酵，但本試驗獲得的山羊莫拉菌在葡萄糖、蔗糖的檢測中呈陽性。鏡檢結果顯示，本試驗獲得的山羊莫拉菌為桿菌，王江博[14]曾在文章中提到山羊莫拉菌為球菌。藥敏試驗結果顯示，本試驗獲得的山羊莫拉菌對阿莫西林、四環素、多西環素、慶大霉素、阿奇霉素、氯霉素、頭孢曲松、磺胺異噁唑等多種抗菌藥物高度敏感。雖然山羊莫拉菌目前對多種抗菌藥物敏感，但作為人體和哺乳動物呼吸道的常駐菌，在當今濫用抗菌藥物導致耐藥菌株不斷增多的嚴峻形勢下，不可忽視每一種潛在病原菌在抗菌藥物壓力下產生耐藥性的能力。