子宮內(nèi)膜樣腺癌中PLAGL1和ERβ的表達及臨床意義

沈玉婷，羅文武，趙榮榮，吳正升，2

子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1]，而子宮內(nèi)膜樣腺癌(uterine endometrioid adenocarcinoma, UTEA)是其最常見的病理類型[2]。目前，早期UCEC首選手術(shù)治療[3]，而對于有生育要求、手術(shù)禁忌或失去手術(shù)機會的患者，尋找理想的分子標志物具有重要意義。多形性腺瘤基因L1(pleomorphic adenoma gene like-1, PLAGL1)可通過多種途徑阻滯細胞周期、介導細胞凋亡，與細胞的多種生理功能及病理狀態(tài)密切相關(guān)[4-5]。ESR2編碼雌激素受體β蛋白(estrogen receptor β, ERβ)，在UCEC中通過拮抗雌激素發(fā)揮腫瘤抑制作用[6]。目前，尚未有PLAGL1與UTEA的文獻報道。因此，本文著重探討PLAGL1和ERβ在UTEA中的表達、相關(guān)性及兩者與臨床病理特征的關(guān)系，旨在為UTEA的早期診斷、個性化治療及預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年10月～2021年3月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院高新院區(qū)病理科存檔的84例UTEA石蠟包埋組織，其中43例病變局限，取遠離病灶>2 cm子宮內(nèi)膜組織作為對照[7]。患者年齡29～73歲，中位年齡53歲，臨床資料均完整，術(shù)前均未接受化療、放療或生物治療等干預措施，無惡性腫瘤個人史及家族史。全子宮切除術(shù)后內(nèi)膜病變切片均由兩位病理專家共同閱片，根據(jù)WHO(2014)子宮腫瘤組織學分類[8]及2009年FIGO標準[9]進行病理診斷、腫瘤分級及臨床分期。

1.2 方法

1.2.1腫瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫 使用TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫挖掘腫瘤基因信息，與正常組織比較，基因表達譜分析篩選UCEC中差異表達基因：在Projects項目中檢索TCGA-UCEC，獲得546例RNA原始測序數(shù)據(jù)完整樣本；在Exploration項目中檢索TCGA-UCEC，獲得包含PTEN、PIK3CA、ARID1A、FAT4、PLAGL1、ATRX、CHD4等575個基因；獲取數(shù)據(jù)后進行表達差異基因分析，篩選得到目標基因PLAGL1。進一步獲取與PLAGL1基因共表達的基因數(shù)據(jù)，獲得包含HYMAI、ATP8A2、ESR2、RAP2C、PKN2、PLAG1、SAT2等20 120個基因，依據(jù)Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果得到目標基因ESR2。

1.2.2UALCAN數(shù)據(jù)庫 使用UALCAN(http: //ualcan.path.uab.edu/index.html)數(shù)據(jù)庫進一步分析TCGA中PLAGL1和ESR2的RNA原始測序數(shù)據(jù)，分析PLAGL1和ESR2 mRNA在正常子宮內(nèi)膜及UCEC中的表達，使用表達量的中位數(shù)進行后續(xù)統(tǒng)計學分析。

1.2.3免疫組化 采用免疫組化MaxVision法染色，將手術(shù)切除的UTEA及癌旁正常子宮內(nèi)膜石蠟包埋組織連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟至水，經(jīng)檸檬酸法高溫修復、3%H2O2封閉和PBS緩沖液沖洗后分別加入PLAGL1小鼠單克隆抗體(ab181457，1 ∶100)及ESR2兔抗人多克隆抗體(14007-1-AP，1 ∶50)。4 ℃過夜，PBS沖洗后加入即用型免疫顯色試劑(MaxVision-HRP鼠/兔)，孵育后PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，鏡下觀察。病理科存檔的UTEA組p53染色切片，均由Roche公司全自動免疫組化儀(型號Benchmark U1t)檢測。選用福州邁新公司的即用型一抗p53(Kit-0010)，二抗及顯色系統(tǒng)、復染液均為全自動免疫組化儀自帶封閉套裝。

1.3 結(jié)果判讀PLAGL1蛋白表達主要定位于細胞核，ERβ蛋白表達定位于細胞質(zhì)，呈淡黃色至棕黃色為陽性。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(400×)，根據(jù)半定量評分系統(tǒng)進行評分。(1)按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；(2)按陽性細胞百分比計分：PLAGL1組<10%為0分，10%～30%為1分，31%～60%為2分，>60%為3分[10]；ERβ組<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分[7]。將兩項得分結(jié)果相加：≤3分為低表達，>3分為高表達[7,10]。p53判讀標準：腫瘤細胞核著色即為陽性，p53陽性率>60%或<5%為p53錯義突變(計為p53+)，5%～60%為p53野生型(無p53突變，計為p53-)[2]。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析使用Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常子宮內(nèi)膜及UCEC組織中PLAGL1和ESR2 mRNA的表達UALCAN數(shù)據(jù)庫顯示：35例正常子宮內(nèi)膜組織和546例UCEC中PLAGL1 mRNA相對表達量的中位數(shù)分別為11.97和3.95，UCEC中PLAGL1 mRNA表達顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.01，圖1A)；而正常子宮內(nèi)膜組織和UCEC中ESR2 mRNA相對表達量的中位數(shù)分別為0.28和0.39，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1B)。

2.2 UTEA及正常組織中PLAGL1和ERβ的表達采用免疫組化MaxVision法檢測84例UTEA及43例正常組織中PLAGL1和ERβ的表達，結(jié)果顯示：PLAGL1表達主要定位于細胞核，細胞質(zhì)中少量表達；在正常子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞中廣泛表達，且腺體中表達較高；PLAGL1在UTEA細胞中高表達率為34.5%，在正常組織中高表達率為74.4%，兩者相比差異有顯著性(P<0.01，表1，圖2A、B)。ERβ表達定位于細胞質(zhì)，在正常子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細胞、UTEA細胞中均有表達。ERβ在UTEA細胞中的高表達率為39.3%，在正常組織中的高表達率為34.9%，兩組相比差異無顯著性(P>0.05，表1，圖2C、D)。血管內(nèi)皮細胞中PLAGL1和ERβ均不表達。

圖1 正常子宮內(nèi)膜及UCEC中PLAGL1和ESR2 mRNA的表達：A.正常子宮內(nèi)膜及UCEC中PLAGL1 mRNA的表達B.正常子宮內(nèi)膜及UCEC中ESR2 mRNA的表達

圖2 UTEA及正常組織中PLAGL1和ERβ的表達：A.UTEA中PLAGL1的表達，MaxVision法；B.正常組織中PLAGL1的表達，MaxVision法；C.UTEA中ERβ的表達，MaxVision法；D.正常組織中ERβ的表達，MaxVision法

2.3 UTEA中PLAGL1和ERβ表達與臨床病理特征的關(guān)系PLAGL1表達與UTEA腫瘤分級、臨床分期、腫瘤累及子宮頸、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和p53錯義突變均顯著相關(guān)(P均<0.05，表2)。其中高分化組PLAGL1高表達率為50.0%，顯著高于低分化組(25.9%，P<0.05)；Ⅰ期組PLAGL1高表達率為50.0%，顯著高于Ⅱ+Ⅲ期組(6.7%，P<0.05)。腫瘤浸潤子宮頸間質(zhì)組和侵及>1/2子宮體肌層組PLAGL1的高表達率分別為9.5%和11.1%，顯著低于未累及子宮頸和侵及≤1/2子宮體肌層組(42.9%、45.6%，P<0.05)。7例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PLAGL1均呈低表達，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中62.3%的PLAGL1呈低表達，兩者差異有顯著性(P<0.05)。PLAGL1在伴p53突變的UTEA組中高表達率為26.4%，顯著低于無p53突變組(48.4%，P<0.05)。PLAGL1表達與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)(P均>0.05，表2)。ERβ在高分化UTEA組中高表達率為46.7%，與低分化組相比(35.2%)，差異無顯著性(P>0.05)；Ⅰ期組ERβ高表達率為37.0%，與Ⅱ+Ⅲ期組相比(43.3%)，差異無顯著性(P>0.05)。ERβ在伴p53突變的UTEA組中高表達率為41.5%，與無p53突變組相比(35.5%)，差異無顯著性(P>0.05)。ERβ表達與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分級、臨床分期、腫瘤累及子宮頸、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和p53突變均無關(guān)(P均>0.05，表2)。

2.4 UTEA中PLAGL1與ERβ表達的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析UTEA中PLAGL1與ERβ的表達相關(guān)性，結(jié)果顯示：UTEA中PLAGL1與ERβ的表達呈顯著正相關(guān)(r=0.236，P<0.05，表3)。

3 討論

PLAG家族成員包括PLAG1、PLAGL1和PLAGL2，以核蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的形式在調(diào)節(jié)細胞正常生理功能中發(fā)揮重要作用[4]。其中PLAGL1基因定位于6號染色體q24上，編碼抗增殖轉(zhuǎn)錄因子，在正常組織中廣泛表達，與生理代謝、遺傳和多種病理狀態(tài)相關(guān)[5]。PLAGL1在人正常腎小球、近曲小管、遠曲小管和集合管中差異表達，提示PLAGL1可以通過作為轉(zhuǎn)錄因子和(或)核受體的轉(zhuǎn)錄輔助激活或阻遏因子來調(diào)節(jié)多種基因的表達，兩種模式下PLAGL1基因的作用可以重疊，提示PLAGL1基因能夠整合、調(diào)控多條信號通路[10]。

表1 UTEA及正常組織中PLAGL1和ERβ的表達[n(%)]

表2 UTEA中PLAGL1和ERβ表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 UTEA中PLAGL1與ERβ表達的相關(guān)性

PLAGL1作為腫瘤抑制因子，通過促進細胞凋亡、阻滯細胞周期抑制腫瘤生長。本組證實UTEA中PLAGL1蛋白表達水平顯著低于正常組織，與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，提示抑癌基因PLAGL1異常表達可能致UTEA的發(fā)生。本實驗挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫腫瘤信息進行基因表達譜分析，結(jié)果顯示：PLAGL1在不同類別的腫瘤中差異表達。文獻報道[11]，卵巢癌中6號染色體q24-q25區(qū)域的高甲基化抑制PLAGL1基因轉(zhuǎn)錄，是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動事件。Jacobs等[12]報道PLAGL1基因表達缺失與前列腺良性病變向惡性腫瘤的轉(zhuǎn)變相關(guān)，PLAGL1失活促進前列腺癌進展。結(jié)腸癌中PLAGL1 mRNA水平顯著低于正常組織，PLAGL1表達失調(diào)可能參與結(jié)腸癌進展[5]。在腎透明細胞癌中PLAGL1表達水平顯著升高，支持PLAGL1表達與腫瘤發(fā)生相關(guān)，有望成為預后標志物，但其分子機制仍不明確[13-14]。基因表達譜分析提示PLAGL1基因在乳腺癌中表達上調(diào)[15]，但尚無基礎(chǔ)實驗證實。有研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌中PLAGL1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，提示在肝細胞癌發(fā)生過程中可能存在PLAGL1異常轉(zhuǎn)錄。

本實驗進一步分析PLAGL1蛋白表達水平與UTEA臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：UTEA高分化組PLAGL1蛋白表達水平顯著高于低分化組，提示PLAGL1參與腫瘤分化；臨床Ⅰ期UTEA中的PLAGL1蛋白表達水平顯著高于Ⅱ～Ⅲ期，提示PLAGL1失活可能增加腫瘤侵襲性，UTEA中PLAGL1蛋白表達下調(diào)可能提示腫瘤累及子宮頸、侵及>1/2子宮體肌層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在病理診斷為UTEA的子宮腔標本中檢測PLAGL1蛋白可能為后續(xù)手術(shù)方式的選擇、患者預后的評估提供參考。已有研究[16]證實，PLAGL1可與p53基因相互作用形成異源二聚體，誘導垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽受體(PACAP1-R)的表達，可誘導基因轉(zhuǎn)錄，抑制細胞增殖。在UCEC中誘導腫瘤抑制蛋白p53表達可激活細胞凋亡通路，提示上調(diào)p53可抑制腫瘤進展、改善患者預后[18]。本組結(jié)果顯示：UTEA中p53錯義突變者伴PLAGL1蛋白表達下調(diào)，提示p53基因可能與PLAGL1協(xié)同發(fā)揮腫瘤抑制作用，聯(lián)合抑制p53、PLAGL1基因失活可能抑制UTEA進展。

ESR2是卵巢顆粒細胞中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，ESR2缺失的顆粒細胞表現(xiàn)出較強的遷移能力、侵襲性和較弱的黏附性[19]，卵巢癌的發(fā)生與ESR2缺失相關(guān)，可能是由雌激素與其受體和輔助因子的局部作用失調(diào)所致[20]。研究[21]發(fā)現(xiàn)，ERβ在胃癌中較正常組織高表達，抑制ESR2在胃癌細胞的內(nèi)源性表達可誘導細胞凋亡，從而阻滯胃癌細胞增殖、促進自噬，提示ESR2可能成為潛在治療靶點。結(jié)腸癌中ESR2 mRNA顯著降低，但ESR2下調(diào)與患者總生存期縮短無關(guān)，上調(diào)ESR2表達無法改善患者預后[22]。ESR2作為腫瘤抑制基因，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、腎透明細胞癌等惡性腫瘤中表達下調(diào)，而彌漫大B細胞淋巴瘤中ESR2 mRNA顯著升高，提示ESR2表達異常是多基因、多通路相互作用的結(jié)果，檢測ESR2表達水平可用于評估患者預后[7]。本實驗證實，ERβ表達與UTEA患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分級、臨床分期、腫瘤累及子宮頸、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和p53突變均無關(guān)；而PLAGL1與ERβ的表達呈正相關(guān)，提示抑癌基因ESR2可能依賴與PLAGL1基因相互作用、協(xié)同發(fā)揮腫瘤抑制作用。

綜上所述，UTEA中PLAGL1蛋白表達水平顯著降低，可以作為UTEA病理診斷及分子分型的生物學標志物，為臨床個體化治療及預后風險評估提供參考。PLAGL1和ERβ異常表達可能聯(lián)合參與UTEA的發(fā)生、發(fā)展，關(guān)于PLAGL1和ESR2在UTEA中的協(xié)同作用機制仍需進一步驗證。