丹燈通腦膠囊對腦缺血再灌注大鼠腸道菌群的影響*

張豐榮，李晴晴，王均琪，王玉艷，李賢煜，4，李志勇，，李彥文

(1.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；2.山東中醫藥大學中醫學院，濟南 250355；3.中央民族大學藥學院，北京 100081；4.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700；5.中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700)

據世界衛生組織統計，腦卒中是世界上第二大死亡原因和第三大致殘原因[1]；其中以缺血性腦卒中發病率最高，約占腦血管疾病的80%[2]。缺血性腦卒中是由于大腦中動脈閉塞導致部分腦組織損傷[3]，在中醫理論中，腦卒中稱為中風，是由肝陽上亢、飲食失調、瘀血阻滯等因素引起[4]，臨床以猝然昏仆、不省人事、半身不遂、口舌歪斜等為主要表現。

腸道微生物參與微生物-腸-腦軸的功能調控，在腸道與大腦的信息交流中發揮著非常重要的作用，“微生物-腸-腦軸”主要由迷走神經、交感神經、免疫系統和腸道微生物群等組成，影響神經傳遞等作用[5]，是當前研究的熱點。腸道菌群其可能通過調節慢性炎癥、自主神經系統和新陳代謝等途徑參與缺血性卒中的發病機制[6]，腦血管性疾病與腸道菌群息息相關[7-8]。

丹燈通腦膠囊由燈盞細辛、丹參、川芎和葛根4種藥物組成，為治療缺血性腦卒中的彝藥成方代表[9]，臨床用于治療急性腦梗死[10]、腦梗死恢復期[11]、椎-基底動脈供血不足導致的眩暈[12]等。丹燈通腦膠囊可能通過抗血栓、抑制興奮性氨基酸釋放等機制有效治療腦梗死[13]，但其抗腦缺血-再灌注損傷的腸道菌群機制仍不明確。故本文以大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion model，MCAO)再灌注損傷模型大鼠為研究對象，初步探究丹燈通腦膠囊對腦缺血再灌注損傷的腸道菌群改變，為深入研究其分子機制提供新視角。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性成年SD大鼠，60只，體質量(300±10) g，由斯貝福生物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK(京)2019-0010，飼養于中國中醫科學院針灸研究所動物室IVC籠具，每籠5只，實驗前適應性喂養3～5 d，動物予12 h的明暗循環，飼養溫度為(23±2)℃，相對濕度(55±2)%，自由進食和飲水。

1.2材料與試藥 MCAO栓線(北京西濃科技有限公司，2838-50A2)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC，北京西濃科技有限公司)；DNA抽提試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司，E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)；瓊脂糖(西班牙Biowest 公司，biowest agArose)；FastPfu Polymerase(美國TransGen公司)；AxyPrep DNA Gel(美國Axygen公司，Axygen Biosciences)；建庫試劑盒(美國Bioo Scientific公司，NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit)；測序試劑盒(美國Illumina公司，MiSeq Reagent Kit v3)。金納多來源為Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co.KG，規格：銀杏葉提取物40 mg/片，批準文號：國藥準字H20090296；丹燈通腦膠囊來源為云南神威施普瑞藥業有限公司，規格：每粒0.35 g，批準文號：國藥準字Z20026053。

1.3實驗儀器 高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司，型號：Eppendorf 5430R)；超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：NanoDrop2000)；酶標儀(美國Biotek公司，型號：BioTekELx800)；電泳儀(北京市六一儀器廠，型號：DYY-6C)；PCR儀(美國ABI公司，型號：ABI GeneAmp 9700)；Illumina Miseq測序儀(美國Illumina公司)。

1.4腦缺血-再灌注模型的制備 釆用改良Longa方法[14]制備MCAO大鼠模型。大鼠術前12 h禁食但不禁水。使用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射45 mg·kg-1麻醉大鼠后，頸部褪毛消毒，鈍性分離頸部肌肉組織群，結扎頸外動脈及頸總動脈的近心端，從頸總動脈遠心端插栓線進入頸內動脈，栓線進入長度(20±2) mm，術后立即肌內注射青霉素藥液預防感染。90 min后，拔出栓線實現再灌注。假手術組僅分離血管，不栓線，其他操作同樣。

1.5分組及給藥 將造模成功的58只大鼠根據神經功能評分的結果，平均每組均納入1分、2分和3分的大鼠。隨機分為5組：假手術組(Control)13只、模型對照組(Model)11只、金納多組(Ginaton，陽性藥組)20 mg·kg-112只、丹燈通腦膠囊大劑量組(DDTN-H)378 mg·kg-110只，丹燈通腦膠囊小劑量組(DDTN-L)42 mg·kg-112只[13]。術后待大鼠蘇醒后即刻灌胃，給藥體積0.1 mL·(100 g)-1，連續給藥21 d，假手術組及模型對照組灌胃給予等容積蒸餾水。

1.6神經功能評分 造模后58只大鼠利用Longa法[15]進行神經功能評分，取評分介于1～3分納入研究，見表1。蘇醒后2 h和給藥21 d分別進行評分。

表1 大鼠神經功能評分 Tab.1 Neurological function score of rats

1.7TTC染色 末次給藥結束30 min后完全隨機選取每組神經功能評分為2分的大鼠3只處死，分離其腦組織并固定于腦模具后，迅速放入-20 ℃冰箱冷凍約15 min取出，冠狀位切片，第一刀在視交叉部位，第二刀在漏斗柄部位，第三刀在漏斗柄與后葉尾極之間，厚度每片2 mm。將腦片置于1%TTC染液中，避光37 ℃染色10 min。

1.8蘇木精-伊紅(HE)染色 末次給藥30 min后每組取大鼠6只，將全腦在4%多聚甲醛固定24 h之后，脫水，石蠟包埋并修整，切到視交叉與漏斗柄中間部位的位置，每張切片厚4 μm，進行HE染色。

1.9腸道菌群檢測

1.9.1DNA抽提和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增 取大鼠糞便，放置于凍存管中液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。根據DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek)說明書抽提總DNA，使用超微量分光光度計進行DNA純度和濃度檢測，利用1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測抽提的DNA完整性，合成上游引物 338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT，選擇16SrDNAV3-V4區作為目的基因，進行PCR擴增。

1.9.2熒光定量和高通量測序 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，Tris_HCl洗脫，使用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統定量檢測。通過NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit試劑盒建庫，利用Illumina公司的Miseq PE300進行測序。

1.9.3生物信息學分析 通過篩選測序的原始序列，得到有效數據進行操作分類單元(operational taxonmic unit，OTU)的群落聚類及其物種組成。使用mothur(version v.1.30.1)計算Alpha多樣性，利用UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)對β多樣性距離矩陣進行層級聚類(Hierarchical clustering)。通過PCoA法分析個體或群體間的差異。利用R語言的stats包和Python的scipy包進行組間顯著性差異檢驗，評估組間顯著性差異物種。使用Networkx工具計算網絡的節點聯通性(degree)，緊密系數(closeness centrality)，介數中心性(betweeness centrality)等屬性分析生物相關性網絡，利用PICRUSt軟件對樣本中微生物群落的Pathway通路進行預測。

1.10統計學方法 數據采用IBM SPSS Statistics 21版統計軟件進行分析，不同組間比較分析利用單因素方差分析(LSD和SNK法)，方差不齊，則采用秩和檢驗；不符合正態分布，使用Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 6.0進行統計數據的圖形繪制。

2 結果

2.1神經評分結果 大鼠蘇醒2 h后，假手術組大鼠未出現腦缺血相關癥狀且行動正常，模型對照組大鼠呈現出不同程度的神經功能缺失。與模型對照組相比，給藥21 d后，丹燈通腦膠囊給藥組(即丹燈通腦膠囊大小劑量組)均使MCAO大鼠神經行為學評分明顯降低(P<0.01)，金納多組大鼠神經功能評分降低(P<0.05)，見表2。

表2 5組大鼠神經功能評分結果 Tab.2 Score results of neurological function of rats

2.2TTC染色結果 假手術組腦未見白色梗死區，模型對照組腦組織可見明顯的白色梗死區，給藥21 d后，丹燈通腦膠囊給藥組和金納多組大鼠腦梗死區域有一定縮小，其中丹燈通腦膠囊大劑量組效果最好，見圖1。

A.假手術組；B.模型對照組；C.丹燈通腦膠囊小劑量組；D.丹燈通腦膠囊大劑量組；E.金納多組。圖1 5組大鼠腦組織梗死區TTC染色結果 A.sham operation group；B.model control group；C.DDTN-L group；D.DDTN-H group；E.EGb group.Fig.1 TTC staining results of rat's brain tissues in five groups

2.3HE染色 見圖2，假手術組大鼠腦片結構完整清楚，神經細胞排列整齊，數目較多，細胞核大而清晰，核仁完整。模型對照組大鼠腦組織皮層梗死區和缺血周邊區域神經細胞排列紊亂、稀疏、核仁變小。與模型對照組比較，丹燈通腦膠囊給藥組和金納多組大鼠腦神經細胞損傷程度較輕，完整細胞數明顯增加，其中大劑量效果更好。

A.假手術組；B.模型對照組；C.丹燈通腦膠囊小劑量組；D.丹燈通腦膠囊大劑量組；E.金納多組。圖2 5組大鼠腦組織HE染色結果 A.sham operation group；B.model control group；C.DDTN-L group；D.DDTN-H group；E.EGb group.Fig.2 HE staining results of rats' brain tissues in five groups

2.4各組大鼠腸道菌群組成結構分析

2.4.1OTU分析結果 根據OTU聚類結果分析，假手術組、模型對照組、丹燈通腦膠囊小劑量組和丹燈通腦膠囊大劑量組共有OTU數目為589個，各個組別特有的OTU數目分別為：假手術組(42個)、模型對照組(29個)、丹燈通腦膠囊小劑量組(21個)、丹燈通腦膠囊大劑量組(26個)。根據腸道菌屬水平聚類分析結果，4個組別共有屬數量為131個，各個組別特有的屬數目分別為：假手術組(8個)、模型對照組(6個)、丹燈通腦膠囊小劑量組(0個)、丹燈通腦膠囊大劑量組(9個)，見圖3。分析結果表明各組大鼠的腸道菌群種類在OTU和屬水平均較穩定。

A.假手術組；B.模型對照組；C.丹燈通腦膠囊小劑量組；D.丹燈通腦膠囊大劑量組。圖3 5組大鼠糞便OUT和菌屬的組成 A.sham operation group；B.model control group；C.DDTN-L group；D.DDTN-H group.Fig.3 Composition of OUT and bacteria in feces of rats in five groups

2.4.2腸道菌群結構分析 假手術組、模型對照組、丹燈通腦膠囊給藥組大鼠結腸內容物優勢菌群均為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)等。在門水平上，和模型對照組比較，丹燈通腦膠囊給藥組的擬桿菌門和變形菌門增加，厚壁菌門水平降低，其中丹燈通腦膠囊小劑量組變化尤為顯著。見圖4。

A.假手術組；B.模型對照組；C.丹燈通腦膠囊小劑量組；D.丹燈通腦膠囊大劑量組。圖4 5組大鼠糞便腸道菌群在門和屬水平的分布情況 A.sham operation group；B.model control group；C.DDTN-L group；D.DDTN-H group.Fig.4 Distribution of fecal intestinal flora of rats in five groups at phylum and genus levels

2.4.3組內樣品多樣性分析 本研究通過統計Alpha多樣性(Sobs、Chao、ACE、Simpson和Shannon)指數來評價各組微生物多樣性差異，單個樣品Alpha多樣性指數見表3，測序深度指數(Coverage指數)均達到0.995以上，表明本次測序結果可以代表各組樣品中物種的真實情況。

表3 5組樣本α多樣性指數 Tab.3 Alpha diversity index of five groups of samples

2.4.4PCoA分析 基于Unweightde Unifrac距離進行PCoA分析，如圖5所示，橫坐標PC1的貢獻度為16.44%，縱坐標為PC2的貢獻度為10.66%。其中，模型對照組和假手術組能直觀地區分，丹燈通腦膠囊給藥組在PC1軸上更接近假手術組，說明丹燈通腦膠囊給藥組與假手術組的部分腸道菌群種類具有相似或者一致性。

圖5 基于Weighted Unifrac距離的PCoA分析 Fig.5 PCoA analysis based on Weighted Unifrac distance

2.4.5物種差異分析 在門水平，與模型對照組相比，丹燈通腦膠囊小劑量組在厚壁菌、擬桿菌和放線菌(Actinobacteria)菌差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6；在屬水平，與模型對照組相比，在丹燈通腦膠囊小劑量組擬普雷沃菌(Alloprevotella)(P<0.05)、克里斯滕森菌(Christensenellaceae_R-7_group)(P<0.01)差異有統計學意義，見圖7。橫坐標代表物種豐度，縱坐標展示的是照豐度由大到小排序的物種，右側*表示該物種在分組間差異有統計學意義。

A.全部菌群組間差異；B.Firmicutes的組間差異；C.Bacteroidetes組間差異；D.Actinobacteria組間差異分析(①P<0.05；②P<0.01)。圖6 基于Kruskal-Wallis H test的門水平菌群組間差異分析 A.intergroup differences of all bacterial；B.intergroup differences of Firmicutes；C.intergroup differences of Bacteroidetes；D.intergroup differences of Actinobacteria (①P<0.05；②P<0.01).Fig.6 Difference analysis of flora at phylum level among groups based on Kruskal-Wallis H test

A.假手術組；B.模型對照組；C.丹燈通腦膠囊小劑量組；D.丹燈通腦膠囊大劑量組；①P<0.01；②P<0.05。圖7 基于Kruskal-Wallis H test的屬水平組間差異分析A.sham operation group；B.model control group；C.DDTN-L group；D.DDTN-H group；①P<0.01；②P<0.05.Fig.7 Difference analysis of flora at genus level among groups based on Kruskal-Wallis H test

2.4.6關聯網絡分析 基于關聯網絡分析，瘤胃球菌(g-norank-f-Ruminococcaceae)、脫硫弧菌(g-norank-f-Desulfovibrionaceae)、類桿菌(g-Bacteroides)、瘤胃球菌1(g-Ruminococcus-1)、瘤胃球菌2(g-Ruminococcus-2)、顫桿菌克(g-Oscillibacter)、毛螺菌(g-Lachnospira)、瘤胃球菌(g-Ruminococcaceae-NK4A214-group)、未分類普雷沃氏菌(g-unclassified-f-Prevotellaceae)等的degree最高，說明以上菌群在關聯網絡中較重要(P<0.05)，見表4。

表4 網絡中心系數 Tab.4 Network center coefficient

2.4.7功能預測 通過COG功能聚類分析得到24條功能，與模型對照組比較，丹燈通腦膠囊大劑量組增加了RNA加工和修飾(RNA processing and modification)、染色質結構和動力(chromatin structure and dynamics)等功能，丹燈通腦膠囊小劑量組增加染色質結構和動力(chromatin structure and dynamics)、核苷酸轉運和代謝(nucleotide transport and metabolism)等功能。通過PICRUSTs數據庫預測到6013條KO信息和284條KEGG代謝通路。與模型對照組比較，丹燈通腦膠囊小劑量組在TCA循環(TCA cycle)、乙醛酸和二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)等豐度增加；丹燈通腦膠囊給藥量組在糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogene-sis)、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝(cysteine and methionine metabolism)、丙酸酯代謝(propanoate metabolism)、精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)等相對豐度降低，見圖8。

A.假手術組；B.模型對照組；C.丹燈通腦膠囊小劑量組；D.丹燈通腦膠囊大劑量組。圖8 丹燈通腦膠囊治療腦缺血再灌注大鼠的COG功能和KEGG通路 A.sham operation group；B.model control group；C.DDTN-L group；D.DDTN-H groupFig.8 COG function and KEGG pathway of DDTN capsule in the treatment of cerebral ischemia-reperfusion in rats

3 討論

據估計，人類相關的微生物群包含多達100萬億個微生物，這個數目比人體內存在的人類細胞數目多10倍[16]。腸道菌群主要包含擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門等[17-18]。目前，腸道菌群越來越受到中外學者的關注，其與缺血性卒中的關系逐漸成為研究的新熱點[19]。臨床上缺血性腦卒中或短暫性腦缺血發作(transient ischemic attack，TIA)患者的腸道菌群存在顯著差異，表現為腸桿菌屬、巨型球菌屬以及脫硫弧菌屬等機會致病菌增多，而擬桿菌門中的擬桿菌屬和普氏菌屬以及厚壁菌門中的柔嫩梭菌群細菌數量減少[20]。在門水平上，模型對照組大鼠厚壁菌水平有所降低，而擬桿菌水平升高，丹燈通腦膠囊給藥組大鼠比模型對照組的擬桿菌和變形菌增加，厚壁菌水平降低。

腸道菌群紊亂與缺血性腦卒中嚴重程度呈正相關[21-23]。缺血性腦卒中患者的腸道紊亂可能與宿主代謝和炎癥密切相關[24]。腸道菌群能產生或刺激其代謝物釋放神經遞質和短鏈脂肪酸等物質，參與調節神經元和星形膠質細胞等生物學過程[18，25]。金納多(ginkgo biloba，EGb)能延遲海馬神經元死亡和細胞凋亡，減少缺血性腦損傷[26]。李丹等[19]發現丹燈通腦膠囊可能通過降低谷氨酸引起的興奮毒性和細胞內鈣離子內流而顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷。本研究也發現相比較于模型對照組，丹燈通腦膠囊給藥組神經細胞損傷程度較輕。

通過KEGG通路豐度變化情況研究發現丹燈通腦膠囊小劑量組比模型對照組的TCA循環、乙醛酸和二羧酸代謝、氧化磷酸化等通路相對豐度較增加。文獻報道，缺血性腦卒中會觸發腸道菌群功能失調并增加腸道通透性，模型大鼠糞便中乙酸、丁酸、戊酸水平與其神經功能評分和腦缺血損傷程度呈負相關[27]。丹燈通腦膠囊給藥量組與模型相比，糖酵解/糖異生、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、丙酸酯代謝、精氨酸生物合成等相對豐度降低。在腦組織缺血缺氧時，腦組織中與糖異生、糖酵解相關代謝物水平顯著升高，而與三羧酸循環有關的代謝物顯著降低[28]。腸道菌群中如擬桿菌屬、普氏菌屬和普氏菌屬等合成琥珀酸，將其作為激活糖異生的底物而改善小鼠的葡萄糖穩態[29]。丹燈通腦膠囊可能通過改善擬桿菌屬、普氏菌屬等菌群產物來調節糖酵解/糖異生等代謝途徑，而減輕對腦缺血再灌注的損傷。精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的催化下，合成信號分子一氧化氮(nitric oxide，NO)并生成瓜氨酸。NO的生成能舒張血管，減輕動脈粥樣硬化。但NO對神經系統的作用具有雙面性，過量的NO會導致腦神經細胞死亡，過度激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspertic acid，NDMA)受體，造成神經元損傷[30]。丹燈通腦膠囊可能通過降低精氨酸生物合成豐度，減少NO生成，從而減輕腦組織神經元損傷。在21 d內腸道菌群相對豐度相應改變也說明腸道微生物能夠對丹燈通腦膠囊藥物的干預做出反應，這可能與各菌門的代謝產物有關。

綜上，丹燈通腦膠囊可能通過改善腦缺血-再灌注模型大鼠的菌群結構，增加擬桿菌門和變形菌門，降低厚壁菌門水平，參與TCA循環、乙醛酸和二羧酸代謝、糖酵解/糖異生、丙酸酯代謝、精氨酸生物合成等通路，發揮防治腦缺血再灌注的作用。