NEDD4L和ULK1在非小細胞肺癌中的表達及預后價值*

吳松，郝小康，張振華，高曉，杜偉平

（1.三二〇一醫院 醫學檢驗科，陜西 漢中 723000；2.西藏民族大學附屬醫院 檢驗科，陜西 咸陽 712082；3.三二〇一醫院 心胸外科，陜西 漢中 723000；4.陜西省核工業二一五醫院 病理科，陜西 咸陽 712000；5.延安大學附屬醫院 檢驗科，陜西 延安 716000）

肺癌是全球常見的呼吸系統惡性腫瘤，每年發病患者約180 萬例，死亡約159 萬例[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常見的類型。雖然分子靶向治療及免疫治療等改善了NSCLC 患者的生存預后，但5年總體生存率仍較差，僅20%左右[2]。NEDD4 樣E3 泛素蛋白連接酶（NEDD4L）的編碼基因位于18q21.31，其編碼蛋白屬于HECT 域E3 泛素連接酶的NEDD4 家族成員，能將E2 泛素結合酶轉移到蛋白質底物，從而降解特定蛋白質進行溶酶體[3]。有研究表明，NEDD4L 在腫瘤中發揮抑制腫瘤的功能，通過抑制促癌因子（如缺氧誘導因子1α）的表達，抑制惡性腫瘤的發生、發展，在胃癌及卵巢癌等惡性腫瘤中NEDD4L表達下調，促進腫瘤的惡性進展[4-5]。UNC-51 樣激酶1（ULK1）編碼基因位于12q24.33，編碼蛋白參與ULK1 復合物構成，整合不同磷酸化和泛素化的信號傳導，是促進自噬起始的主要因子[6]。有研究表明，腫瘤中ULK1作為一種促癌基因，在乳腺腺癌、胃癌等惡性腫瘤中表達上調，能使磷脂酰肌醇3 激酶復合物磷酸化，促進腫瘤細胞的惡性增殖[7-8]。本研究通過檢測NSCLC 癌組織中NEDD4L、ULK1 的表達，初步探討兩者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2018年1月三二〇一醫院收治的88 例NSCLC 患者作為研究對象。其中男性55例，女性33例；年齡36～79歲，平均（59.2±7.8）歲；病理類型：腺癌60 例，鱗癌28 例；腫瘤直徑≤5 cm 52例，＞5 cm 36例；腫瘤TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期57 例，Ⅲ期31例。病理分級：高中分化49例，低分化39 例；有淋巴結轉移19 例，無淋巴結轉移69 例。納入標準：①經病理組織學檢查明確診斷為NSCLC，由2 位病理科醫師共同診斷；②初次診治，無放化療、靶向治療史；③臨床及隨訪資料完整；④患者和家屬對本研究知情同意，能夠配合完成隨訪。排除標準：①伴肺炎等感染性疾病或類風濕性關節炎等自身免疫系統疾病；②伴其他惡性腫瘤；③心肺器官衰竭，體能狀態較差，KPS 評分＜70分。本研究經醫院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑和儀器

兔單克隆NEDD4L 抗體、兔單克隆ULK1 抗體購自美國Abcam 公司，二步法免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，顯微鏡購自日本Olymbus 株式會社。

1.3 方法

將癌組織和癌旁組織放入10%甲醛溶液中固定24 h。石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟2遍，10 min/次，梯度酒精脫水，每個梯度5 min。切片放入檸檬酸緩沖液中微波爐加熱至煮沸，維持5 min 抗原熱修復。避光室溫滴加3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，一抗4℃避光過夜（NEDD4L 稀釋比1∶500，ULK1 稀釋比1∶400），二抗室溫30 min，二氨基聯苯胺顯色30 s，蘇木素核染2 min，鹽酸酒精分化5 s，梯度酒精脫水，中性樹脂封片。200 倍顯微鏡下觀察陽性表達部位的染色強度和范圍，染色評分根據染色強度（0 分為無染色，1 分為染色淺，2 分為染色深）和染色面積（0 分為≤25%，1 分為＞25%～＜50%，2 分為≥50%）的乘積評估。總分＜2 分為陰性表達，≥2 分為陽性表達。應用R 語言分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中NSCLC 及其癌旁組織中NEDD4L 和ULK1 mRNA 的表達差異。患者隨訪3～36 個月，平均（30.1±4.3）個月。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距[M（P25，P75）]表示，比較用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Spearman 法；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用log-rank χ2檢驗；影響因素的分析用單因素或多因素Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 癌組織與癌旁組織中NEDD4L、ULK1 mRNA相對表達量比較

NSCLC 癌組織與癌旁組織中NEDD4L mRNA 相對表達量分別為4.32 （3.62，5.02）、5.46 （5.14，5.79），ULK1 mRNA 分別為4.63（3.92，5.35），4.27（3.98，4.56），經Mann-WhitneyU檢驗，差異有統計學意義（Z=8.433 和3.793，均P=0.000），癌組織NEDD4L mRNA 相對表達量低于癌旁組織，ULK1 mRNA 相對表達量高于癌旁組織。見圖1。

圖1 NSCLC癌組織與癌旁組織NEDD4L、ULK1 mRNA相對表達量比較

2.2 NSCLC癌組織與癌旁組織中NEDD4L、ULK1蛋白表達及陽性表達率比較

NSCLC 癌組織中NEDD4L 陽性表達主要位于細胞漿和細胞膜，ULK1 陽性表達主要位于細胞核（見圖2）。癌組織中NEDD4L 的陽性表達率為26.1%（23/88），癌旁組織為73.9%（65/88），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=40.091，P=0.000），癌組織低于癌旁組織。癌組織中ULK1 的陽性表達率為75.0%（66/88），癌旁組織為25.0%（22/88），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=44.000，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。

圖2 癌組織NEDD4L、ULK1蛋白表達 （×200）

2.3 不同臨床特征患者的癌組織中NEDD4L、ULK1陽性表達率比較

有無淋巴結轉移、不同TNM 分期患者的癌組織NEDD4L、ULK1 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其余指標的NEDD4L、ULK1 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床特征患者的癌組織中NEDD4L、ULK1陽性表達率比較 例（%）

2.4 NSCLC患者NEDD4L與ULK1表達的相關性

Spearman 相關性分析結果顯示，NEDD4L 與ULK1 的表達呈負相關（rs=-0.587，P=0.000）。

2.5 癌組織中NEDD4L和ULK1表達對NSCLC患者生存預后影響

隨訪期間死亡32 例，3年總體生存率為63.6%（56/88）。NEDD4L 陽性表達患者3年總體生存率為87.0%（20/23），NEDD4L 陰性表達患者為55.4%（36/65），經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.114，P=0.008），NEDD4L 陰性表達患者3年總體生存率較陽性表達患者低。NEDD4L 陽性表達患者平均生存時間為（32.2±5.0）個月，NEDD4L 陰性表達患者為（21.4±4.2）個月，經t檢驗，差異有統計學意義（t=10.075，P=0.000），NEDD4L 陽性表達患者平均生存時間較陰性表達患者長。見圖3。

ULK1 陽性表達患者的3年總體生存率為54.55%（36/66），ULK1 陰性表達患者為90.91%（20/22），經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.814，P=0.002），ULK1 陽性表達患者3年總體生存率較陰性表達患者低。ULK1 陽性表達患者的平均生存時間為（33.4±5.3）個月，ULK1 陰性表達患者為（20.7±4.6）個月，經t檢驗，差異有統計學意義（t=10.041，P=0.000），ULK1 陽性表達患者平均生存時間較陰性表達患者長。見圖3。

圖3 NEDD4L和ULK1表達對NSCLC患者生存預后的影響

2.6 單因素及多因素Cox 回歸分析影響NSCLC預后的危險因素

將年齡（＜60 歲= 0，≥60 歲= 1）、性別（男= 0，女= 1）、腫瘤直徑（≤5 cm= 0，＞5 cm= 1）、病理類型（腺癌= 0，鱗癌=1）、病理分級（高中分化= 0，低分化=1）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ期= 0，Ⅲ期= 1）、淋巴結轉移（無= 0，有= 1）、NEDD4L（陽性= 0，陰性= 1）、ULK1（陰性= 0，陽性= 1）作為自變量，將NSCLC 患者隨訪過程中的生存狀態作為因變量（死亡= 1，存活=0），做單因素及多因素Cox 回歸分析。

表3 影響NSCLC患者預后的單因素Cox回歸分析參數

多因素Cox 回歸分析結果顯示，NEDD4L 陰性表達[=1.878（95% CI：0.961，2.995）]、ULK1 陽性表達[=1.679（95% CI：0.785，2.884）]及腫瘤TNM分 期Ⅲ期[=1.937（95% CI：1.131，3.317）] 是NSCLC 患者不良預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響NSCLC患者預后的多因素Cox回歸分析參數

3 討論

NSCLC 作為肺癌的最常見類型，約占85%[9]，大多數NSCLC 患者初次診斷時癌細胞即發生轉移[10-11]。在過去20年里，隨著腫瘤生物學和腫瘤進展機制的研究，NSCLC 的治療取得了重要進展。然而，NSCLC 的總體治愈率和存活率仍然很低。因此，需要研究新的預后判斷的腫瘤標志物，以改善NSCLC 的療效[12]。

NEDD4L 是一種E3 泛素蛋白連接酶，包含1 個HECT 結構域。NEDD4L 的下游靶點多數是膜蛋白，包括離子通道和轉運蛋白，NEDD4L 活性對于維持血壓和正常生理機能發揮重要的作用[13]。有研究表明，NEDD4L 在腫瘤中發揮抑癌因子的作用，其通過調控腫瘤信號通路的Dvl2 蛋白質的降解，導致Wnt信號通路抑制，抑制腫瘤的侵襲和轉移[14]。近年來研究表明，多種腫瘤中存在NEDD4L 表達下調，通過影響腫瘤細胞的線粒體代謝，促進腫瘤的惡性增殖、浸潤、轉移[15]。本研究中NSCLC 癌組織中NEDD4L 在mRNA 及蛋白表達均明顯降低，與WANG等[16]報道結果一致。NEDD4L 表達下調的機制與微小RNA 調控有關。有研究表明，微小RNA-513a-5p能夠結合于NEDD4L mRNA 的3’非編碼區域，促進NEDD4L mRNA 的降解，抑制NEDD4L 的表達[17]。此外，WANG 等[16]報道Zeste 同源物2（EZH2）介導的多梳組蛋白增強子H3K27 甲基化，能夠抑制NEDD4L的表達，敲低EZH2 的表達后NEDD4L 的表達再次升高，進一步證實了EZH2 對NEDD4L 的調控功能。本研究發現，NSCLC 腫瘤分期Ⅲ期、有淋巴結轉移的NSCLC 癌 組織中NEDD4L 表達 較低，提示NSCLC 中NEDD4L 的低表達與腫瘤惡性進展有關。分析其原因，NEDD4L 的表達下調可導致下游靶蛋白SMAD2和SMAD7 的積累，SMAD2 和SMAD7 能夠導致轉化生長因子β（TGF-β）信號通路激活，促進腫瘤細胞的遷移及侵襲，導致腫瘤的進展[18]。此外，JIANG 等[4]發現NEDD4L 能夠泛素化降解缺氧誘導因子1A，NEDD4L 表達下調后導致缺氧誘導因子1A 的下游靶點如血管內皮生長因子表達升高，促進腫瘤血管生成，促進腫瘤的惡性發展。

ULK1 是哺乳動物中ATG1 基因的同源物，能與自噬蛋白如FIP200 等形成蛋白質復合物，調節自噬的啟動，是自噬過程中重要的細胞質激酶[19]。研究表明，ULK1在人類乳腺癌及胃癌等多種腫瘤中表達上調，作為重要的致癌基因，能夠在營養缺乏的環境中通過蛋白質-蛋白質相互作用誘導自噬發生，并促進腫瘤的增殖[7-8]。因此，ULK1 是腫瘤中一種具有潛力的重要的診斷治療靶點。本研究中，NSCLC 癌組織中ULK1 的表達量明顯高于癌旁組織，表明NSCLC 中ULK1 表達上調。分析其原因，ULK1 參與構成ULK 復合物，ULK 復合物誘導自噬的發生。有研究發現，ULK 復合物直接受mTOR 和AMP 活化蛋白激酶（AMPK）的調控，其在腫瘤中的表達促進ULK1 的表達[20]。此外，本研究中NSCLC癌組織中ULK1 的表達與腫瘤TNM 分期及淋巴結轉移有關，表明ULK1 可能促進NSCLC 腫瘤的發生、發展。有學者報道，腫瘤中ULK1 的過度活化增強線粒體自噬能力，促進NLRP3 炎癥小體過度激活，大量趨化因子的分泌導致腫瘤細胞的骨轉移[21]。有研究發現，自噬在腫瘤發展的各個階段會有所不同，在腫瘤發展的早期，自噬通過直接殺傷來限制腫瘤細胞的增殖。然而，在腫瘤已經形成之后，對缺血缺氧壓力的反應增加腫瘤細胞的存活、侵襲和轉移[22]。因此，ULK1 在腫瘤進展期及晚期中可能發揮更為重要的腫瘤促進功能。

筆者進一步分析NEDD4L、ULK1 與NSCLC 患者生存預后關系，結果NEDD4L 陰性表達、ULK1 陽性表達的NSCC 患者生存預后較差，提示NEDD4L、ULK1 是判斷NSCLC 患者預后的重要指標。本研究利用單因素及多因素Cox 回歸分析發現，腫瘤TNM分期Ⅲ期、NEDD4L 陰性表達和ULK1 陽性表達是NSCLC 患者不良預后的獨立危險因素。因此，NEDD4L、ULK1 是重要的NSCLC 的腫瘤標志物，檢測NSCLC 癌組織中NEDD4L、ULK1 的表達有助于患者的預后。筆者發現，NSCLC 癌組織中NEDD4L 與ULK1 的表達呈負相關，表明兩者可能存在相互作用的關系。LEE 等[23]報道，NEDD4L 通過降低抑制腫瘤細胞ULK1 的磷酸化激活，抑制自噬和線粒體代謝，從而抑制胰腺癌細胞的增殖。因此，在NSCLC 中NEDD4L 通過對ULK1 活性的調控，進而影響腫瘤細胞的線粒體代謝過程，影響腫瘤的發生、發展。但NSCLC 中兩者的具體作用機制有待深入探索。

綜上所述，NSCLC 中NEDD4L 表達下調，ULK1表達上調，兩者表達與腫瘤TNM 分期及淋巴結轉移有關。NEDD4L 低表達、ULK1 的高表達的NSCLC 患者預后較差，且是NSCLC 患者不良生存預后的獨立危險因素，其有望成為新的判斷NSCLC 預后的分子標志物。但本研究樣本例數有限，且是回顧性研究，有待今后設計大樣本、前瞻性臨床研究證實。