溴苯基姜黃素對膽管癌細胞裸鼠移植瘤抑制作用及機制

趙冀安 張梅 張蕊 董梁 聶文佳 劉文聰 劉維麗

(河北醫科大學第一醫院 1普通外科，河北 石家莊 050013；2感染性疾病科；3消化內科；4醫務處；5超聲科；6肝膽外科)

膽管癌惡性程度高、發病隱匿、診治困難，所以發病率和死亡率呈上升趨勢。外科根治性切除為膽管癌治療首選，其對放化療均不敏感，所以預后較差，遠期治療效果欠佳〔1〕。尋找有效抑制膽管癌細胞增殖侵襲的方法，是目前困擾臨床醫生的主要問題。姜黃素(CUR)是姜黃的有效成分，在臨床實驗中對肝癌、結腸癌、乳腺癌等癌癥有很強的抗腫瘤作用〔2〕。但是臨床研究顯示由于其生理條件下的不穩定性，使其出現了較差的生物活性和藥代動力學特征，從而限制了它在抗癌治療方面的應用〔3,4〕。溴苯基CUR(GL63)是CUR的一種衍生物，具有明顯的水溶性和穩定性，且具有較高的細胞通透性、生物利用度和抗腫瘤活性〔5〕。Wang等〔6〕表明與CUR相比，GL63能更有效地抑制信號轉導和轉錄活化因子(STAT)3磷酸化，下調STAT3下游靶點陣列，從而抑制細胞增殖、集落形成、細胞遷移和侵襲及誘導細胞凋亡。本研究選用人膽管癌RBE細胞和BALB/C-nu雌性裸鼠制造移植瘤動物模型，研究GL63對細胞和移植瘤的抑制作用，并研究其機制。

1 材料與方法

1.1材料 GL63由河北科技大學劉守信教授合成并提供。人膽管癌RBE細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。BALB/C-nu雌性裸鼠，6周齡，體重16～18 g，購于河北醫科大學動物中心，并在SPF級環境中飼養。RPMI1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司，磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)2、磷酸化(p)-STAT3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-2和β-actin兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2RBE細胞的培養 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基對人膽管癌RBE進行培養，置于含5% CO2的37℃的培養箱中。當培養瓶底部貼壁細胞達90%以上時，用0.25%胰酶消化傳代并進行實驗。為了進行細胞集落分析，將1 000個細胞/孔分3次接種在6孔板中，并在37℃和5% CO2的加濕室內培養2 w。RBE細胞集落用1%結晶紫染色計數。

1.3噻唑藍(MTT)比色法檢測RBE細胞增殖抑制率 將對數生長期的RBE細胞培養12 h，棄去培養基，各組分別加入含1%二甲基亞礬的不同濃度GL63(0、10、20 μmol/L)。分別培養8 h、12 h和24 h后，每孔加入20 μl的5 mg/ml MTT溶液，繼續培養4 h，吸取上清液后，每孔加入150 μl二甲基亞砜，低速搖床震蕩10 min后用酶聯免疫吸附試驗儀檢測570 nm每孔的吸光度(OD)值。抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4流式細胞術分析細胞凋亡和細胞周期情況 對數生長期RBE細胞以1×105/孔接種于6孔板中，培養24 h后，棄培養液，加入不同濃度的GL63處理(0、10、20 μmol/L)。繼續培養24 h后收集、洗滌細胞，先加膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V)5 μl，再加丙酸碘10 μl混勻，避光反應20 min后，用流式細胞儀測定細胞凋亡率和細胞周期。

1.5移植瘤模型建立和分組 收集乙二胺四乙酸(EDTA)消化的對數生長期人膽管癌RBE細胞，將其配制成濃度為1×107個/ml的單細胞懸液，接種到裸鼠背部皮下，接種后觀察。待裸鼠皮下腫瘤直徑增至5～6 mm時認為成瘤，按照每組10只隨機分對照組和低、高濃度GL63組，各組裸鼠瘤體大小差異無統計學意義。低、高濃度GL63組裸鼠腹腔分別注射10、20 μmol/L GL63溶液0.2 ml，對照組注射等量無菌生理鹽水。給藥3次/w，共4 w。用藥后每隔4 d測量腫瘤體積，腫瘤體積=1/2長徑×短徑2，4 w后處死各組裸鼠，完整剝取腫瘤，對裸鼠身體重量和腫瘤重量進行測量，抑瘤率=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重×100%。

1.6病理組織學檢測 10%甲醛固定腫瘤組織，制備成4 μm厚度連續石蠟切片，常規二甲苯脫蠟、水化、抗原微波修復，山羊血清封閉，滴加細胞增殖抗原(PCNA，1∶100)4℃冰箱過夜。滴加鏈霉素蛋白-過氧化氫酶溶液標記二抗，孵育后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，二氨基聯基膠(DAB)顯色。每次染色設同步陽性和陰性對照。光鏡下觀察、攝片，隨機選取5個視野，觀察陽性細胞。PCNA蛋白表達定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色。無著色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細胞占計數細胞比例：染色比例小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，大于50%為3分。2項相加為最后判斷結果：兩者分數之和最大值為6，0～2分陰性表達，>2分為陽性表達。

1.7Western印跡 切取腫瘤組織碾碎低溫超聲勻漿，加入蛋白質提取液裂解，高速離心后收集上清液，電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再用5%脫脂牛奶封閉，隨后加入1∶1 000的兔抗人p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、TIMP-2和β-actin多克隆抗體4℃過夜。而后用TBST清洗后再分別加入1∶5 000標記的山羊抗兔抗體，室溫孵育后經電化學發光(ECL)檢測，用圖像分析軟件進行分析。

1.8統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組不同時間點RBE細胞增殖抑制率比較 RBE細胞的增殖和克隆形成隨GL63濃度增加而下降。RBE細胞形態和增殖率在顯微鏡下觀察發現，不同濃度GL63在不同時間點作用于RBE細胞，抑制率逐漸升高，細胞增殖率逐漸降低。表明GL63可顯著抑制RBE細胞增殖，其增殖抑制率呈濃度和時間依賴關系(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組培養不同時間點抑制率比較

圖1 各組RBE細胞集落形成

2.2各組RBE細胞凋亡率和細胞周期比較 與對照組〔(1.32±0.30)%〕相比，低、高濃度GL63組凋亡率〔(28.42±4.40)%、(64.55±6.60)%〕顯著升高，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，高濃度GL63組細胞凋亡誘導作用最為明顯；G0/G1期細胞比例隨GL63濃度增加而升高。對照組G0/G1期細胞比例〔(34.58±1.09)%〕、明顯低于低、高濃度GL63組〔(51.26±0.45)%、(68.69±0.85)%；均P<0.05〕。表明GL63阻滯細胞周期于G0/G1期，促使細胞發生凋亡，見圖2、圖3。

圖2 流式細胞學檢測各組RBE細胞凋亡率

圖3 流式細胞學檢測各組RBE細胞周期

2.3各組裸鼠體重、瘤重、瘤體積的抑瘤率比較 實驗期間各組裸鼠均未出現死亡，3組裸鼠體重無顯著差異(P>0.05)；與對照組比較，低、高濃度GL63組瘤重和瘤體積明顯低，抑瘤率明顯高，且高濃度組瘤重和瘤體積更低，抑瘤率更高(均P<0.05)，見表2。說明GL63對裸鼠RBE移植瘤增長有明顯的抑制作用。

表2 治療后各組裸鼠體重、瘤重、瘤體積和抑瘤率的比較

2.4各組移植瘤組織病理形態 對照組腫瘤細胞形態較大，呈巢、片狀排列，細胞核大且深染，核仁明顯，病理性核分裂多見。腫瘤周圍可見血管和淋巴管。而低、高濃度GL63組細胞與對照組相比，分化程度較高，未發現明顯淋巴管侵犯和血管內瘤栓形成，見圖4。提示GL63能影響裸鼠移植瘤增殖分化。PCNA蛋白表達定位于細胞核，呈棕褐色顆粒狀，染色較深。對照組大部分移植瘤細胞PCNA表達陽性，而低、高濃度GL63組移植瘤細胞PCNA表達(48.5±4.1、72.3±6.4)顯著低于對照組(115.2±8.3)，且高濃度GL63組腫瘤細胞PCNA表達量明顯低于低濃度GL63組(均P<0.05)，見圖5。說明GL63能夠抑制膽管癌細胞的增殖。

2.5Western印跡檢測各組移植瘤組織相關基因表達 與對照組比較，低、高濃度GL63組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著下降，而Bax和TIMP-2蛋白表達顯著增高，且呈濃度依賴性(均P<0.05)，見表3、圖6。

圖4 各組移植瘤光鏡下形態(HE染色，×400)

圖5 免疫組化檢測各組移植瘤PCNA蛋白表達(PCNA染色，×400)

表3 各組移植瘤組織相關基因表達比較

1～3：對照組、低濃度GL63組、高濃度GL63組圖6 Western印跡檢測各組移植瘤組織相關基因表達

3 討 論

膽管癌是來源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，但由于其起病隱匿，大多數患者診斷為該疾病時已到中晚期，往往失去根治性切除機會，而目前的化療藥效果不佳，所以該疾病預后極差。因此尋找高效低毒的抗腫瘤藥物對治療膽管癌和提高患者生存期具有重要意義。國內多個研究初步顯示CUR及其衍生物尤其是GL63具有廣泛的抗腫瘤活性。Xiao等〔7〕實驗證明GL63和CUR對正常肝細胞未發生誘導凋亡現象，說明GL63無明顯毒性。本研究在體外和體內抗腫瘤實驗中首次證實GL63能抑制膽管癌RBE細胞的增殖和促進其發生凋亡，且細胞周期停滯于G0/G1期。

本研究中GL63抑制了STAT3磷酸化，使STAT3無法再二聚體化，進而抑制STAT3進入細胞核內，使其調節下游基因表達能力下降，從而促進了膽管癌細胞發生凋亡。結果說明GL63在裸鼠體內有效地抑制了JAK2/STAT3信號通路，通過減少STAT3及其下游抗凋亡蛋白的表達，抑制細胞增殖和誘導其凋亡來抑制腫瘤的增長。

JAK2/STAT3信號通路在細胞增殖、凋亡、分化和免疫功能等多種生理過程中起發揮重要作用，當發生異常活化時會導致細胞出現異常增殖甚至惡變〔8,9〕。磷酸化的STAT3通過與基因的啟動子區域結合來充當轉錄因子，以調節細胞周期進程、細胞凋亡、血管生成、腫瘤侵襲和轉移〔10〕，如胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸癌、乳腺癌和其他癌癥，包括膽管癌〔11〕。STAT3調控下游靶基因包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、生存蛋白(survivin)和促凋亡蛋白Bax、Bcl-2同源拮抗劑(Bak)〔12,13〕，所以抑制STAT3的活化即可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進癌細胞凋亡〔14〕。阻斷JAK2/STAT3通路成為治療惡性腫瘤的方向之一。有研究表明GL63通過調控STAT3下游靶點，抑制人肝癌細胞HepG2和鼻咽癌細胞CNE2增殖，主要是通過內質網應激途徑誘導細胞周期停滯和隨后的細胞凋亡，減少Bcl-2蛋白表達，而促進Bax蛋白表達增高〔7,15〕。

轉移是癌癥最具破壞性的因素，也是癌癥患者預后不良和死亡的主要原因。它由一系列相互關聯、循序漸進的步驟組成，包括細胞黏附、細胞外基質(ECM)降解、細胞運動和侵襲。腫瘤細胞要發生遷移和侵襲，要先對ECM進行降解，而MMP-2和MMP-9是降解ECM的主要蛋白酶〔16,17〕。因此，抑制MMP表達被認為是預防癌癥轉移的早期靶點〔18〕。本研究結果證明GL63可抑制RBE細胞的遷移侵襲能力，且呈濃度依賴性。

PCNA在細胞核內合成，為DNA聚合酶的輔助蛋白，在細胞周期調控中發揮重要功能的核蛋白，其合成、表達與細胞周期相關。PCNA參與DNA的合成，是反映細胞增殖的重要指標，其表達在判定腫瘤良惡性和惡性程度方面有著不可替代的作用〔19〕。PCNA作為反映細胞增殖期和評定肝癌細胞核惡性度的指標會發生顯著升高〔20〕。本研究結果進一步證明GL63有很好的體內抗膽管癌的作用。

綜上，GL63可有效地抑制JAK2/STAT3信號通路，進而阻斷STAT3磷酸化，以此影響下游蛋白表達，從而抑制了腫瘤細胞增殖和局部侵襲等惡性生物學行為并促進其凋亡。GL63在膽管癌的治療中可發揮安全有效的抗腫瘤作用，有可能成為治療和預防膽管癌的有效藥物。