依達拉奉對間歇低氧大鼠神經細胞Apaf-1、Survivin蛋白表達及認知功能的影響

王玲 王袁 黃超 張敏 張盼盼 喻昌利

(1華北理工大學附屬醫院呼吸科，河北 唐山 063000；2秦皇島市第一醫院呼吸科)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是由于夜間睡眠過程中頻繁發生上呼吸道部分(低通氣)或完全(呼吸暫停)阻塞所致的一種以擾亂正常肺換氣和睡眠結構為主的慢性呼吸障礙性疾病〔1〕。OSAHS因長期慢性間歇性缺氧可導致多器官多系統損傷，其中以腦功能受損較為顯著，主要表現為認知功能障礙〔2〕。依達拉奉不僅可抑制神經元延遲死亡和脂質過氧化物的產生，還可保護運動神經元免受自由基和氧化應激損傷，以達到改善神經功能的作用〔3〕。細胞凋亡是調節細胞死亡的主要機制，與缺氧引起的細胞死亡密切相關〔4〕。凋亡肽酶激活因子(Apaf)-1 及存活素(Survivin)是與凋亡密切相關的相關因子〔5〕。目前，關于依達拉奉對認知功能的影響已有報道，但對間歇低氧損傷后凋亡相關蛋白Apaf-1、Survivin表達的影響鮮有報道。本文通過觀察依達拉奉對OSAHS 患者Apaf-1、Survivin蛋白表達水平的影響，探討依達拉奉改善認知功能障礙的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑 Apaf-1及Survivin兔抗鼠多克隆抗體、IgG羊抗兔單克隆抗體購自上海恒遠生物科技有限公司；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒及PV6001試劑盒購自三鷹生物技術有限公司；低氧箱及氮氣、氧氣購自唐山市友誼公司。

1.2實驗動物及分組 72只SPF級Wistar雄性大鼠〔體重(180±10)g〕，動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。采用隨機數字表法分為對照組、5%間歇低氧(IH)組、依達拉奉組，每組24只，每組又分為10、21、28 d 3個時間亞組，每個時間亞組8只大鼠。

1.3動物模型的制備 制備間歇低氧大鼠動物模型。間歇低氧組大鼠低氧箱內首先注入30 s的氮氣，流速壓力為0.15 MPa，使低氧箱內最低氧濃度達5%，接下來注入40 s的壓縮空氣，流速壓力為0.8 MPa，使氧濃度升至21%，繼續注入50 s流速壓力不變的壓縮空氣，使氧濃度維持在21%。上述120 s為1個周期，反復進行循環。依達拉奉組大鼠于間歇低氧實驗前30 min尾靜脈注入依達拉奉(3 mg/kg)。對照組大鼠的是實驗箱持續注入壓縮空氣，流速為3 L/min，控制實驗箱內氧濃度為21%。3組實驗大鼠每日進行實驗8 h，持續進行10、21、28 d。

1.4免疫組化檢測Apaf-1及Survivin蛋白表達 固定后的大鼠，腦組織經二甲苯透明、切片等制備免疫組織切片。按PV兩步法操作步驟，將準備好的切片進行滴加一抗(Apaf-1兔抗大鼠抗體 1∶500稀釋、Survivin兔抗大鼠抗體1∶500稀釋)、滴加二抗等步驟，最后應用DAB顯色試劑盒進行顯色，封片后顯微鏡下攝片。

1.5Morris水迷宮實驗 每只大鼠于實驗設計的時間點進行測試，晨起進行穿越平臺及逃避潛伏期的訓練，訓練結束后進行上述實驗的測試，每只大鼠每天上下午各進行測試6次，記錄大鼠的逃避潛伏期時間及穿越目標象限的時間，取平均值。

1.6統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗和重復測量方差分析。

2 結 果

2.1免疫組化檢測Apaf-1及Survivin蛋白表達 光學顯微鏡下顯示，對照組各個時間點Apaf-1及Survivin蛋白表達較少；與對照組比較，5%IH組及依達拉奉組各個時間點Apaf-1、Survivin蛋白的表達明顯增多(P<0.05)；與5%IH組比較，依達拉奉組各個時間點Apaf-1蛋白表達均明顯減少，Survivin蛋白表達均明顯增加(均P<0.05)，見表1，圖1，圖2。

表1 3組不同時間點Apaf-1表達比較

圖1 光學顯微鏡下觀察兩組Apaf-1蛋白表達(免疫組化，×400)

圖2 光學顯微鏡下觀察兩組Survivin蛋白表達(免疫組化，×400)

2.2Morris水迷宮實驗

2.2.1定位航行實驗 對照組各個時間點逃避潛伏期無明顯差異(均P>0.05)；與對照組比較，5%IH組及依達拉奉組各時間點逃避潛伏期明顯延長(均P<0.05)；與5%IH組比較，依達拉奉組各時間點逃避潛伏期明顯縮短(均P<0.05)，見表2。

2.2.2空間探索實驗 對照組各個時間點跨越目標象限時間無明顯差異(均P>0.05)；與對照組比較，5%IH組及依達拉奉組各時間點目標象限跨越時間明顯縮短(均P<0.05)；與5%IH組比較，依達拉奉組各時間點目標象限跨越時間明顯延長(均P<0.05)，見表2。

表2 3組不同時間點逃避潛伏期及跨越目標象限時間比較

3 討 論

隨著人們生活水平的提高，肥胖、糖尿病等疾病高發，OSAHS患病率呈升高趨勢，是呼吸系統常見病。OSAHS可引起神經系統損害，如認知功能下降，嚴重影響人們的生活及工作〔6〕。依達拉奉作為神經內科重要的腦保護藥物，臨床已廣泛應用。研究證實，依達拉奉可通過抑制炎癥反應、氧化應激等減輕神經系統損傷進而改善認知功能〔7〕。本研究結果說明，間歇低氧損傷造成了大鼠認知功能下降，應用依達拉奉干預后，認知功能得到改善。

Apaf-1在凋亡調節中起關鍵作用，Apaf-1與細胞色素c和dATP結合后組成一個低聚凋亡小體，負責自動催化活化pro-caspase-9(Apaf-3)，進而激活caspase-3和細胞凋亡〔8〕。Survivin屬于凋亡抑制因子(IAPs)基因家族中分子量最小但抑制凋亡能力最強的一員，其被BIRC5基因編碼，可參與控制有絲分裂、調節細胞凋亡和細胞應激反應3個細胞過程〔9〕。研究報道，缺氧性腦損傷通過誘導大鼠腦組織Apaf-1表達，導致神經元凋亡增加〔10〕。有研究也證實了間歇低氧可引起Survivin表達的增加，可能抑制了神經元的凋亡〔11〕。本實驗結果提示，間歇低氧促進了Apaf-1、Survivin蛋白的表達，加用依達拉奉干預后，使促凋亡因子Apaf-1的表達下降，抑制凋亡因子Survivin蛋白的表達增加，進而改善了認知功能。這與既往研究證實依達拉奉通過減少腦損傷后神經細胞的凋亡進而發揮腦保護作用一致〔12〕。

綜上，依達拉奉可通過調節凋亡因子Apaf-1、Survivin蛋白表達的水平，進而改善間歇低氧損傷后大鼠的認知功能。