澤瀉多糖對老年性耳鳴耳聾的治療

張蕊 李羿 宋麗

(成都醫學院藥學院，四川 成都 610500)

隨著年齡增長，老年人的聽覺器官開始衰老退變，雙耳出現進行性和對稱性的聽力減退或無刺激感音，稱為老年性耳鳴耳聾〔1〕。目前，我國65歲以上老年人該病發病率高達33%～48%。并且隨著社會的老齡化，發病率正迅速上升〔2〕，因為老年性耳鳴耳聾發病機制復雜，再加上研究的起步比較晚，因此目前我國對該病的文獻報道較少，治療藥物也不多。中醫理論認為老年多虛，多虛則久聾。隨著年齡增長，老年人精氣衰減，致使精氣不足而難以滋養耳部，出現耳鳴耳聾。因此，老年性耳鳴耳聾的治療可以從抗衰老、補精氣方面入手〔3〕。例如，具有補腎益氣功效的六味地黃丸、耳聾左慈丸等用于治療耳鳴耳聾，療效較好。這些方劑中都含有澤瀉配伍〔4,5〕。澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥塊莖〔6〕。目前澤瀉的研究重心多在其脂溶性部分，而較少關注水溶性部分〔7〕。實驗表明，澤瀉中水溶性活性成分多糖具有顯著的抗氧化、抗衰老和提高免疫力作用〔8〕，對老年性耳鳴耳聾的治療具有一定的積極意義。本研究旨在探討澤瀉多糖對老年性耳鳴。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，雄性，體重20 g左右，購自成都達碩實驗動物有限公司〔動物合格證號：SCXK(川)2013-24〕。試劑與儀器：數碼三目攝像顯微鏡(BA400，麥克奧迪實業集團有限公司)；電子分析天平(YP202N，上海菁海儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV752N，上海佑科儀器儀表有限公司)。澤瀉藥材(180801，四川彭山產，四川新荷花中藥飲片股份有限公司)，經成都醫學院李羿教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥塊莖。丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-2-1，南京建成生物工程研究所)；D-無水葡萄糖對照品(MUST-18032905，成都曼思特生物科技有限公司)；D-半乳糖(G1804160，陜西潤豐生物技術有限公司)。

1.2澤瀉多糖的提取純化 采用水提醇沉法〔9〕提取澤瀉中的多糖類成分，Sevag法〔10〕除去粗多糖中的蛋白質雜質。取澤瀉粉末(65目)，按料液比1∶10加入蒸餾水，于100℃下浸提3 h。抽濾，濃縮濾液。加入一定體積無水乙醇，待沉淀完全后抽濾，濾渣用無水乙醇和乙醚洗滌兩次，干燥，得澤瀉多糖粗品。粗品加水溶解后加入Sevag溶液(氯仿∶正丁醇4∶1)5 ml，以4 000 r/min離心10 min，分離上清液。揮干溶劑，干燥，即得。

1.3澤瀉多糖的含量測定

1.3.1對照品溶液的制備 精密稱取對照品D-無水葡萄糖，加入一定量的蒸餾水使其溶解，配成100 mg/L對照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備 精密稱取1.2中制備的澤瀉多糖，加入一定量的蒸餾水使其溶解，再加1 mol/L的H2SO42 ml，加熱水解2 h，冷卻至室溫，配成100 mg/L供試品溶液。

1.3.3含量測定方法 精密量取1.3.2中制備的供試品溶液2 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml和濃硫酸7.5 ml，混勻，靜置20 min顯色，在484 nm處測定吸光度，計算澤瀉多糖的含量。

1.4澤瀉多糖抗老年耳鳴耳聾的活性研究

1.4.1給藥供試品溶液的制備 稱取5 g1.2中制備的澤瀉多糖，用150 ml 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分散。

1.4.2老年性耳鳴耳聾小鼠模型的建立 將小鼠隨機分成模型組，澤瀉多糖組(均按500 mg/kg劑量腹腔注射D-半乳糖)，空白組(腹腔注射等量生理鹽水)。每天一次，連續給藥70 d。

1.4.3給藥與取樣 按375 mg/kg劑量灌胃給予澤瀉多糖組小鼠1.4.1中制備的供試品溶液；按同等劑量灌胃給予空白組、模型組生理鹽水，每天一次，連續給藥28 d后，取小鼠腦組織和血清。

1.4.4血清中SOD值和MDA值的測定 采用試劑盒對小鼠血清中SOD值和MDA值進行測定。

1.4.5大腦組織聽皮層病理檢測 小鼠大腦組織標本按病理檢驗SOP程序進行脫水、修剪、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片等，最后鏡檢。測量聽皮層正常神經元及異常神經元數量，并計算異常神經元百分比。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1澤瀉多糖的含量測定結果 通過1.3.3中方法測定澤瀉多糖的含量分別為53.92%、56.04%、54.38%、55.80%、 53.22%、55.30%，平均含量為54.78%，相對標準偏差(RSD)為2.04%。

2.2血清MDA、SOD測定結果 與空白組比較，模型組血清SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；澤瀉多糖組血清SOD活力較模型組顯著增大，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組MDA、SOD測定結果

2.3大腦組織聽皮層病理檢測結果 與空白組比較，模型組大腦中聽皮層內神經元出現較明顯損害，異常神經元數量及比例增多(P<0.05)；與模型組比較，澤瀉多糖組大腦中聽皮層內神經元損害程度變化不明顯，異常神經元數量及比例降低，不存在統計學差異(P>0.05)。空白組：大腦組織結構完整，未見明顯的炎性滲出；聽皮層內神經元細胞形態正常，排列整齊；異常神經元小量，細胞顏色變深，體積縮小，內部結構不清晰，細胞核較模糊，細胞尾部偶然可見較為明顯的軸突樣結構；細胞間質內毛細血管豐富，神經纖維較均勻，膠質細胞形態正常，與神經元相比體積較小，未見明顯的增生、壞死和炎性細胞浸潤。模型組：聽皮層內部分神經元壞死，細胞體積縮小，排列紊亂；細胞核縮小，細胞周圍間隙變寬；細胞間質內的毛細血管、神經纖維及膠質細胞等無明顯增生、壞死和炎性細胞浸潤。澤瀉多糖組聽皮層內部分神經元壞死，細胞體積縮小，但排列較整齊；細胞核縮小；細胞間質內的毛細血管、神經纖維及膠質細胞等無明顯增生、壞死和炎性細胞浸潤。見表2和圖1。

表2 各組聽皮層病理檢測結果

↑：壞死神經元圖1 各組聽皮層鏡檢結果

3 討 論

老年性耳鳴耳聾的病因復雜多樣，耳蝸螺旋器、基底膜等老化可引起感音障礙；中樞神經、內耳神經等退化可引起傳導障礙；慢性疾病如高血壓、高脂血癥等可造成血管腔狹窄，內耳供血不足；缺乏鋅元素可影響耳蝸功能等。目前的藥物主要是針對內耳供血不足進行治療，如擴血管藥、降低血液黏稠度和溶解小血栓的藥物及B族維生素等。

本文采用注射D-半乳糖來構建老年性耳鳴耳聾動物模型〔11〕。因為D-半乳糖可使機體細胞(包括聽覺細胞)內氧化酶的活性改變，引發脂質過氧化等反應，產生各種氧化產物(如MDA)，引起細胞的老化損害和功能減退，從而導致機體衰老和聽力障礙。SOD可幫助消除體內的氧自由基，減少細胞的氧化損害和老化凋亡〔12〕。鏡檢時，空白組動物大腦聽皮層內偶見少量深色神經元，可能是由于腦組織樣本在前期處理過程中極易受到外界各種因素的影響而造成的人工假象。本研究結果說明澤瀉多糖具有較好的清除自由基和抗自由基損害的作用，能夠較好地保護耳蝸細胞，從而對老年性耳鳴耳聾的治療具有積極意義。但光鏡下大腦組織聽皮層神經元損害程度和異常神經元百分比均下降不明顯，可能是由于飼養過程中部分老鼠死于打斗引起的創傷性感染，導致樣本數量減少，再加上取樣的局部性，使鏡檢結果僅能代表現有組織切片的病理趨勢，因此后續研究中應進一步擴大樣本量，增大給藥劑量或延長給藥時間。