球型脂聯素對高糖環境下臍靜脈內皮細胞增殖及VEGF表達的影響

李雅嘉 李卿慧 李強翔1， 劉蕾

(1湖南省人民醫院 湖南省老年醫學研究所，湖南 長沙 410008；2寧夏回族自治區人民醫院 寧夏老年疾病臨床研究中心；3中南大學湘雅醫院；4婁底市中心醫院)

冠心病、視網膜病變及腎動脈硬化等作為2型糖尿病的三大主要血管并發癥，其共同的病理學基礎涉及動脈的粥樣硬化性損害〔1〕。糖尿病患者發生的動脈粥樣硬化(AS)發生早、進展快，然而其并未具備特殊的病理組織學特征。其中，內皮功能紊亂在糖尿病血管病變及動脈硬化的發生發展過程中發揮了關鍵性作用。脂聯素被發現是一種具備調節糖與血脂代謝、保護血管功能、維護能量代謝平衡、逆轉血管病變等廣泛生理作用的脂肪細胞因子〔2〕，本研究在高糖環境下使用球形脂聯素(gAd)處理人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，觀察其對高糖環境下HUVEC增殖及血管內皮細胞生長因子(VEGF)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 gAd (北京愛迪博生物科技有限公司購入)，臍靜脈內皮細胞株(武漢原生原代生物醫藥科技有限公司購入)； 細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術研究所)；低糖型DMEM 培養基(美國Gibco 公司)； 胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)； D-葡萄糖和胰蛋白酶粉末(美國Sigma 公司)； CO2培養箱(武漢華海公司)； 倒置生物顯微鏡(OLYMPUS 公司)；全自動酶標讀數儀(美國JB/TEK公司)； LDZX-40C 型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器(北京六一儀器廠)； KH-600DB 型數據超聲波清潔器(日本TOMY公司)；流式細胞儀(德國Biometra公司，PP3000型)。

1.2細胞培養傳代及實驗分組 培養細胞至生長達80%，棄去含血清培基，并更換無血清培基培養24 h。之后分別換成含不同濃度葡萄糖(5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L)的培養基，通過12、24、36、48、72 h 觀察后，確立臍靜脈內皮細胞生長的最適高糖濃度為25 mmol/L。

實驗分組：對照組：含5.5 mmol/L葡萄糖；高糖(HG)組：含25 mmol/L葡萄糖；gAd組：含2.5 μg/ml gAd；HG+gAd組：含50 mmol/L葡萄糖+2.5 μg/ml gAd。VEGF ELISA試劑盒測定不同處理組臍靜脈內皮細胞的上清液中VEGF的含量。

1.3噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖 HUVEC經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，消化，用含0.5% FBS 的M200 培養基制成細胞懸液。經細胞計數，按每孔5×103/150 μl接種于96 孔板。全培養基培養24 h， 棄培養液，換上只含有0.5% FBS的培養基預處理24 h，以達到細胞同步化。分別加入對照組、gAd組、HG+gAd組和HG組培養基。繼續常規培養12、24、36、48、72 h 后，加入MTT 溶液50 μl，使用酶標儀按MTT比法法測定各孔490 nm 和690 nm 的吸光度(OD 值)。每組設3 個復孔，至少重復3次實驗。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0 軟件進行配對t檢驗。

2 結 果

2.1gAd影響高糖培養下HUVEC 增殖活性 與對照組比較，HG組及HG+gAd組明顯抑制了HUVEC增殖(P<0.05)，而gAd組明顯促進了HUVEC增殖(P<0.05)；與HG組比較，gAd組及HG+gAd組對HUVEC的增殖具有促進作用(P<0.05)，見表1。

表1 各組HUVEC增殖的影響

2.2ELISA測定gAd對高糖環境下VEGF蛋白含量的影響 相較于對照組，HG組上清液VEGF蛋白的含量明顯升高(P<0.05)，gAd組與HG+gAd組VEGF蛋白含量明顯降低(P<0.05)；與HG組比較，gAd組與gAd+HG組的VEGF含量明顯降低(P<0.05)。見表1。

3 討 論

研究顯示，血管內皮細胞對維持血管的正常功能及血管新生有著重要作用，其中，血管內皮細胞的增殖在血管新生過程中發揮了關鍵作用。內皮細胞生長因子是一種特異性促血管化生長因子，其能參與促進新生內皮細胞增殖、遷移和維持活性等多個環節〔3,4〕。在通常情況下，內皮細胞VEGF維持較低水平表達，這一特征在維持血管內皮細胞活性及血管結構完整性方面發揮了關鍵作用〔5〕。同時，有證據表明VEGF通過介導血管新生及誘發炎癥反應密切參與了糖尿病并發缺血性疾病的發生發展，維持血管內皮細胞中VEGF平衡是針對糖尿病血管并發癥的重要治療方向〔6,7〕。

脂聯素作為一種脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子，具備調節糖及脂肪代謝、保護血管、抑制血管新生及相關炎性反應的作用，且被證實能有效逆轉血管病變〔8〕。其對動脈粥樣硬化的治療已經被廣泛研究且具備良好前景。gAd即脂聯素在體內循環時存在全長脂聯素和經蛋白水解成的C端球狀結構域，其具備較強生物學活性。

本研究通過提高HUVEC生長條件中葡萄糖水平，建立高糖誘導下HUVEC損傷細胞模型，較好地模擬了適宜HUVEC生存的高糖微環境。MTT實驗驗證了在高糖環境下gAd可逆轉高糖對HUVEC增殖的抑制作用。同時gAd可以下調HUVEC 中VEGF的表達，可以進一步抑制新生血管的生成及組織血管化進程。通過觀察gAd高糖環境下HUVEC的增殖的影響及機制，從而為糖尿病血管并發癥的治療提供實驗依據。