NBP對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力及血清和海馬組織IL-12、IFN-γ和BDNF水平的影響

姚本海 劉海軍 張霞 鄭永素 徐祖才

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

酒精中毒的患者越來越多。酒精中毒所致的心理健康和社會問題是當(dāng)前重大的世界性公共衛(wèi)生問題之一〔1〕。目前治療慢性酒精中毒的手段有限。研究顯示，丁基苯酞(NBP)抑制炎癥反應(yīng)，神經(jīng)元細(xì)胞保護(hù)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)再生等功能〔2〕。本研究基于NBP多靶點(diǎn)的作用，通過慢性酒精中毒大鼠模型的建立，觀察NBP對慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響及血清和海馬組織IL-12、IFN-γ和BDNF水平的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物、儀器與試劑 28只6～8周齡SD雄性大鼠(300～330 g)購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。NBP軟膠囊(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050299)、無水乙醇(西隴科技股份有限公司，國產(chǎn)分析純試劑，批號19012002)、Morris水迷宮系統(tǒng)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號：JLBehv-MWMG動物行為分析軟件)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒(MM-0209R1，酶免)、白細(xì)胞介素(IL)-12/P70試劑盒(MM-0140R1，酶免)、干擾素(IFN)-γ試劑盒(MM-0198R1，酶免)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及慢性酒精中毒大鼠模型建立 將28只大鼠分為正常對照組(n=6)、模型組(n=8)、NBP高劑量組(n=6)、NBP低劑量組(n=8)。除正常對照組大鼠外，其余各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，連續(xù)28 d給予大鼠6%(V/V)酒精水溶液飲用，酒精溶液每日9∶00配制，構(gòu)建慢性酒精中毒大鼠模型〔3，4〕。28 d后按NBP低劑量(10 mg/kg)和高劑量(40 mg/kg)灌胃給藥14 d，模型組正常喂養(yǎng)，對照組灌胃等劑量的玉米油(5 ml/kg)。

1.3行為學(xué)測試 14 d灌胃結(jié)束后，所有大鼠進(jìn)行連續(xù)7 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：用于檢測大鼠對水迷宮的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)前一天預(yù)先將大鼠置于水迷宮中自由游泳60 s，讓其適應(yīng)水迷宮環(huán)境。在學(xué)習(xí)過程中，大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d。每次實(shí)驗(yàn)大鼠在4個不同方向中將頭朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平臺，并允許大鼠在平臺上停留20 s以達(dá)到強(qiáng)化記憶效果。通過攝像觀察并記錄大鼠尋找隱藏在水面下平臺的路線和逃避潛伏期(從入水到爬上平臺所需的時間)，如果大鼠在60 s內(nèi)未到達(dá)平臺，逃避潛伏期以60 s記錄，并由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺停留20 s。水迷宮周圍的標(biāo)志物固定，無聲、光、人的干擾。空間探索實(shí)驗(yàn)：用于檢測大鼠學(xué)會尋找平臺后對平臺的空間位置記憶的能力。前6 d訓(xùn)練結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，將大鼠從原先未游過的方向放入水中，記錄大鼠在目標(biāo)象限及其他象限所花的時間。

1.4血清和海馬組織中IL-12、IFN-γ和BDNF的測定 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射10%的水合氯醛(3 ml/kg)處死大鼠，腹主動脈取血，離心保留血清；并開顱取海馬組織。采用雙抗體夾心法測定血清和海馬區(qū)中 IL-12、IFN-γ和BDNF含量，按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism7軟件，組間的顯著性差異經(jīng)one-way和two-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1NBP對慢性酒精中毒大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組大鼠隨著訓(xùn)練時間延長逃避潛伏期逐漸變短，模型組逃避潛伏期較對照組延長，在第3天時差異明顯(P<0.01)；NBP低劑量和高劑量治療后縮短了大鼠的逃避潛伏期，在第3天和第4天時差異明顯(P<0.05)，見表1。提示NBP改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力是在用藥的中期階段。Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠在平臺象限停留時間〔(17.72±5.37)s〕較正常對照組〔(15.89±5.23)s〕增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；NBP低劑量組〔(11.62±6.30)s〕和高劑量組〔(11.01±7.24)s〕治療后減少了平臺象限停留時間，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組潛伏期比較

2.2NBP對慢性酒精中毒大鼠血清和海馬組織中細(xì)胞因子的影響 與正常對照組相比，模型組血清和海馬組織中IL-12和IFN-γ水平顯著上調(diào)(P<0.01)，BDNF水平顯著下調(diào)(P<0.01)。與模型組比較，NBP低劑量組血清IL-12水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；NBP高劑量組血清IL-12水平顯著降低(P<0.01)；NBP低劑量組和高劑量組血清和海馬IFN-γ及BDNF水平差異顯著(P<0.01，P<0.05)，見表2。說明NBP對慢性酒精中毒大鼠具有保護(hù)作用。

表2 各組血清及海馬組織IL-12、IFN-γ和BDNF含量比較

3 討 論

大量飲酒是全球發(fā)病率和死亡率的最大因素之一〔5〕。研究表明，長期過量飲酒與執(zhí)行功能、記憶和元認(rèn)知能力的認(rèn)知缺陷(從輕度到重度)有關(guān)，并伴有情感過程和社交認(rèn)知的損害〔6〕。本研究表明，NBP在一定程度上可能改善慢性酒精中毒大鼠學(xué)習(xí)、記憶力能力。已有研究表明，NBP 能夠減輕慢性酒精中毒大鼠的癥狀，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇能使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種炎性因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等，通過促進(jìn)炎性介質(zhì)如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶(COX)-2等合成，這些炎癥物質(zhì)對大腦產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)毒性作用，從而導(dǎo)致腦功能損害〔8，9〕。本研究結(jié)果表明，NBP對慢性酒精中毒大鼠炎癥因子有抑制作用，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，對神經(jīng)功能有保護(hù)作用。研究表明，NBP可減輕氧化應(yīng)激，減弱炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元凋亡，并改善突觸可塑性和認(rèn)知功能〔10～12〕。Climent 等〔13〕證實(shí)酒精可降低BDNF的表達(dá)，從而影響神經(jīng)元的生長、分化及生存。研究認(rèn)為，NBP可能通過血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)BDNF的分泌，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞〔14～16〕。NBP可上調(diào)大鼠梗死區(qū)周圍和海馬區(qū)缺血腦組織中BDNF和NGF的表達(dá)，并可能通過此機(jī)制起到保護(hù)作用〔17〕。NBP治療急性腦梗死患者，可下調(diào)炎性因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎效應(yīng)，提高BDNF、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)表達(dá)，修復(fù)神經(jīng)功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔18〕。本研究Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是大鼠樣本量較少，在后期的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。