不同濃度他達那非對感音神經性聾聽力損傷的修復作用

梁媛 郭霞 劉吉娜 趙雷 郝然 曹靜 張淑君

(1承德醫學院附屬醫院耳鼻喉科，河北 承德 067000；2河北大學附屬醫院耳鼻咽喉科)

感音神經性耳聾是導致患者聽覺損傷的常見類型，患者出現聽力障礙，對人們的日常生活帶來嚴重的影響。感音神經性聾是因為機體聽神經、內耳、聽覺中樞發生器質性病變，對聲音感受、分析起到一定的阻礙作用，導致聽力減退，嚴重的會導致聽力完全喪失〔1〕。目前臨床中主要通過擴血管藥物進行治療感音神經性聾，有助于內耳血流量提高，對血管痙攣也起到改善作用〔2〕，但是治療效果不明顯。Liu等〔3〕研究指出，5-磷酸二酯酶(PDE5)蛋白在耳蝸中顯示高表達，提示在聽覺損傷方面PDE5抑制劑具有潛在治療價值。他達那非屬于一種選擇性的PDE5抑制劑，能有效提高機體血液中環磷酸鳥苷(cGMP)、一氧化氮(NO)水平，在選擇性擴張肺血管方面發揮著重要作用〔4〕。目前關于他達那非治療感音神經性聾相關研究較少。本研究探討不同濃度他達那非對感音神經性聾豚鼠模型聽力損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取60只健康雄性豚鼠，鼠齡2個月，體重220～300 g，均由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(冀)2018-008。所有豚鼠耳廓反射靈敏，均在室溫22℃、濕度50%的安靜環境下飼養。

1.2實驗方法

1.2.1感音神經性聾豚鼠模型建立及分組 60只豚鼠中隨機選取12只為正常組，其余48只參考文獻〔5〕建立感音神經性聾模型：采用40 mg/kg戊巴比妥鈉對48只豚鼠給予腹腔麻醉，無菌條件下在豚鼠顱頂雙側皮質聽區，通過硬膜手術將不銹鋼絲慢性電極植入其中，牙科水泥固定1 w，將每只豚鼠單籠飼養，在暴露倉中，白噪音為20～2 000 Hz，通過擴音器(GY型400W)放大，通過揚聲器在暴露倉中播放，頻率分析儀(B&K 2107型)完成連續監測，暴露聲壓級110 dB，1次/d，每次持續1.5 h，連續干預1 w。正常組只做不銹鋼絲慢性電極植入手術。48只模型豚鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各12只。豚鼠對外界聲刺激無反應，耳廓無抖動，耳反射完全消失，耳廓下垂，說明模型建立成功。

1.2.2藥物干預 待模型建立成功后，正常組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，低、中、高劑量組給予他達那非(分別為0.1、1.0、2.0 mg/kg生理鹽水稀釋)腹腔注射，1次/d。各組豚鼠連續干預4 w。

1.2.3耳廓豎立、耳動反射檢查 模型建立后，各組豚鼠均在距離其30 cm位置用力擊掌，觀察各組耳廓豎立、抖動等狀況，擊掌5次，每次間隔2 s，在安靜無雜音的環境中進行，全程錄像記錄實驗數據。評估標準：①豚鼠耳廓無抖動，耳反射完全消失為(-)；②豚鼠耳廓有微弱抖動，耳反射閾值有明顯提高為(+)；③豚鼠耳廓有明顯的抖動，耳反射閾值有提高為()；④豚鼠耳廓抖動靈敏，耳反射閾值無變化為()。

1.2.4聽性腦干反應(ABR)閾值、Ⅰ波潛伏期檢查 在豚鼠清醒狀態下將其關在隔音電屏蔽室中，對豚鼠顱頂部位電極進行記錄，選擇豚鼠同側及對側乳突部位置入參考和接地電極。參考數值設置：濾波帶30～3 000 Hz，1 024次疊加，掃描15 ms，方波脈沖刺激0.1 ms，頻率為20 Hz，統計各組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期數據。

1.2.5氧化應激、炎癥因子相關指標檢測 抽取豚鼠腹部靜脈血3 ml，以3 000 r/min離心速度，離心處理10 min后，分離上層血清。采用硫代巴比妥酸檢測丙二醛(MDA)水平；采用黃嘌呤氧化酶反應檢測超氧化物歧化酶(SOD)水平；采用催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧反應產生NO，與親核性物質形成有色化合物，在530 nm波長下計算誘導型一氧化氮合酶(iNOS)濃度。采用酶聯免疫吸附試驗檢測白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平：將提前稀釋好的標準品100 μl加入相應的微孔板反應空中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37℃下處理90 min，甩去孔內液體，吸干水分；將準備好的抗體加入到每孔中0.1 ml，在37℃下處理60 min，底物四甲基聯苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔內液體，每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔內液體，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光處理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS終止液，即藍色變為黃色。在波長450 mm處分析IL-6、TNF-α水平。

1.2.6耳蝸組織病理學觀察 處死豚鼠，在枕骨大孔處解剖后快速提取耳蝸組織制作標本，將其置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作常規石蠟切片，在濃度0.5%蘇木素-伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片。

1.2.7Notch2、hes1蛋白表達檢測 采用Western印跡檢測，將采集到的血液標本10 000 r/min離心處理10 min，對上清液進行提取后，二喹啉甲酸(BCA)進行蛋白定量檢測，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環境中加熱5 min有助于蛋白發生變性。凝膠電泳完、轉膜，取膜，4℃環境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(Notch2、hes1一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續洗膜3次，處理時間為5 min。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內參。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件行方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組豚鼠耳廓豎立、耳動反射比較 正常組聽覺及耳動反射表現為()，經過外界聲刺激耳廓豎起。模型組經過外界聲刺激，耳廓表現為無抖動，無反射，耳廓下垂，耳動反射為(-)。低劑量組經過外界聲刺激耳廓抖動較弱，耳動反射為(+)，耳廓下垂；中劑量組經過外界聲刺激耳廓有抖動，耳動反射為()，耳廓半豎起半下垂；高劑量組經過外界聲刺激耳廓明顯抖動，耳動反射為()，耳廓豎起，下垂不明顯。見圖1。

2.2各組豚鼠ABR閾值、Ⅰ波潛伏期比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 各組豚鼠耳廓豎立情況比較

表1 各組豚鼠ABR閾值、Ⅰ波潛伏期、氧化應激及炎癥因子相關指標比較

2.3各組豚鼠氧化應激及炎癥因子相關指標比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組SOD水平降低，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4各組豚鼠耳蝸組織病理學觀察 正常組耳蝸組織未見淋巴積水，前庭膜完整、平直，鼓階、前庭階、蝸管結構完整。模型組耳蝸組織出現不同程度的積水，前庭階方向隆起擴張，有前庭膜發生破裂。低劑量組、中劑量組、高劑量組積水程度均有不同程度的緩解，其中中劑量組前庭膜膨隆程度較輕，高劑量組淋巴積水消失，前庭膜正常，病理學狀況得到明顯改善。見圖2。

圖2 各組耳蝸組織病理學觀察(HE染色，×200)

2.5各組Notch2、hes1蛋白表達比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組Notch2、hes1蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組Notch2、hes1蛋白表達比較

圖3 各組Notch2、hes1蛋白表達

3 討 論

感音神經性聾屬于一種常見的聽力損傷疾病，其發病原因是因為耳蝸中的毛細胞被損害，堅持早發現、早治療，能最大程度地恢復患者聽力〔6〕。豚鼠與其他實驗動物相比具有發達的神經系統，對聲音的敏感性較高，一方面試因為豚鼠為大耳廓，聽覺耳動反射較為明顯；另一方是豚鼠的耳蝸結構與人有共同之處，通過解剖能得到完整的耳蝸〔7，8〕，因此本文研究選擇豚鼠作為研究動物。

本研究結果提示，高濃度他達那非對豚鼠形態學變化起到一定的保護作用。ABR屬于一種神經源性電活動，在聽力測試中被廣泛應用，能清晰地顯示各波段的起源，常被用來診斷聽覺損傷〔9〕。相關研究證實，短聲會導致ABR耳蝸底回，短聲引起的低頻刺激會導致毛細胞產生Ⅰ波，一旦發生損傷，行波會出現延遲，與耳蝸鋪片底回尤其是鉤端毛細胞嚴重損傷有關〔10，11〕。本研究結果提示，高濃度他達那非能減輕對豚鼠耳蝸毛細胞損傷，對其聽覺起到一定的保護作用。

MDA是膜脂過氧化過程中產生的主要產物，其水平大量增加會導致細胞膜發生損傷，臨床中常用來反映膜脂過氧化過程損傷程度〔12〕。SOD屬于一種抗氧化酶，在機體中廣泛存在，其生理活性特殊，對機體中的自由基有清除作用，常用SOD含量反映機體受自由基攻擊的嚴重程度〔13〕。活性氧(ROS)是氧氣正常代謝的產物，在其信號轉導過程中NO、過氧化氫等發揮著重要作用。他達那非對加內皮型NO釋放有一定的促進作用，對內皮細胞功能有一定的改善作用〔14〕。本研究中他達那非干預后，豚鼠氧化應激反應被抑制，呈現濃度依賴。Shin等〔15〕研究指出，噪音誘導耳蝸損傷，IL-6在螺旋神經節、側壁細胞中發揮著重要作用。目前已經有研究證實，IL-6能對急性耳蝸損傷有誘導作用〔16〕。TNF-α會促進促炎細胞在耳蝸組織中大量累積〔17〕。本研究證實，高劑量他達那能明顯抑制感音神經性聾豚鼠模型炎癥反應。

Notch蛋白主要存在于細胞膜受體中，對基因轉錄有直接調節作用，通過對細胞分化信號、特化基因表達進行調控，保留細胞特化的潛力〔18〕。hes1屬于Notch信號通路下游中重要的效應因子，在耳蝸的發育中起到參與作用，對毛細胞的分化有調節功能〔19，20〕。Liu等〔21〕研究指出，hes1過表達會抑制毛細胞分化，從而發揮負性調節作用，Notch2/hes1信號通路在毛細胞損傷、修復過程中至關重要。本研究提示，通過調控Notch2/hes1信號通路，參與毛細胞損傷、修復過程，可修復豚鼠聽力損傷。

綜上，他達那非對感音神經性聾豚鼠模型干預效果顯著，能改善豚鼠聽力，通過調控Notch2/hes1蛋白，抑制氧化應激反應及炎癥反應，對聽力損傷起到一定的修復作用。