桑芪首烏片對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制

謝青 魏丹霞 顧力華 楊仁華 劉朵 陳鵬

(1昆明市中醫醫院康復科，云南 昆明 650051;2昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室)

腦缺血再灌注損傷是指腦組織缺血一定時間后重新恢復血液灌注時，腦組織結構損傷及功能障礙進一步加重的現象，其主要引起腦組織細胞凋亡或壞死〔1〕。因此如何最大程度地抑制細胞凋亡，促進細胞再生，對治療腦缺血再灌注損傷具有重要意義。中醫在此方面取得了良好的療效〔2，3〕。國家級名老中醫陸家龍教授根據腦卒中(恢復期)的病因病機潛心研究出的“桑芪首烏方”，具有補益肝腎、益氣活血化瘀功效，該方臨床療效顯著，前期已證實了該方具有神經保護作用〔4，5〕。本文在前期研究基礎上，通過觀察桑芪首烏片對大腦中動脈阻塞缺血再灌注損傷模型大鼠的療效及Notch受體1、Notch胞內結構域(NICD)和Hes家族發狀分裂相關增強子(Hes)1的影響，探討桑芪首烏片對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級SD雄性大鼠60只，體重(270±20)g，購自昆明醫科大學實驗動物學部，許可證號：SYXK(滇)K2015-0002。動物飼養室溫度(22 ± 2)℃，相對濕度50%～65%，自由光照。

1.2藥物 桑芪首烏片，由桑寄生、黃芪、制首烏、生白芍、炒杜仲、當歸、川芎、丹參、天麻、釣藤、黃柏、火麻仁、夜交藤、秫米、炒谷芽、秒麥芽、三七須根17味中藥組成，由昆明市中醫醫院制劑科提供。尼莫地平片(山東新華制藥股份有限公司，20 mg/片，批號：20151121)。

1.3主要試劑與儀器 鼠抗Notch1(A-8)抗體，Santa公司；兔抗NICD(ab8387)抗體，Abcam公司；鼠抗Hes1(E-5)抗體，Santa公司；恒溫振蕩器，中國上海精宏實驗設備有限公司；病理包埋機及切片機，德國Leica公司。1659001 蛋白電泳儀、TPC-0220G型實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀，美國Bio-Rad 公司；PCR逆轉錄儀，德國Biometra公司。

1.4局灶性腦缺血再灌注大鼠模型制備 SD雄性大鼠經適應性喂養1 w后開始造模，實驗前動物禁食12 h，自由飲水。采用Zea-Longa改良的短暫性大鼠大腦中動脈閉塞線栓法(MCAO)并根據《藥理實驗方法學》(第三版)加以改進，復制局灶性腦缺血再灌注模型〔6，7〕。大鼠清醒后Bederson評分≥2分提示造模成功，納入本實驗。滿分為11分，分數越高，表示動物神經行為障礙越嚴重。

1.5分組與給藥 實驗動物造模成功后，隨機分為6組：正常對照組，模型對照組，桑芪首烏片低(0.7 g/kg)、中(1.4 g/kg)、高(2.8 g/kg)劑量組，尼莫地平片陽性對照組，每組10只。術后動物狀態穩定后，正常對照組及模型對照組灌胃蒸餾水，桑芪首烏片低、中、高劑量組及尼莫地平片陽性對照組大鼠均分別灌胃給予相應劑量的受試藥物或陽性藥物。灌胃容量按1.0 ml/100 g體重計，1次/d，連續28 d。

1.6觀察指標與方法

1.6.1神經行為學評分 于手術當天，術后第14天、第28天采用Bederson評分分級法分別對各組進行神經行為學評定并記錄評定結果。

1.6.2梗死灶體積測定 實驗結束，迅速處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，立即放入盛冰鹽水的玻璃杯中，將玻璃杯放入4℃冰箱15 min。取出后按冠狀切面順序切厚度為2 mm的腦片5片，然后將腦片置于氯化三苯四氮唑(TTC)溶液中，避光，放入恒溫振蕩器，溫度設置為37℃，30 min后取出腦片拍照，采用顯微圖像分析系統計算腦梗死體積。

1.6.3蘇木素-伊紅(HE)染色檢測病理形態學改變 取左側腦組織，去除嗅球后切成2 mm腦片，先用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，然后依次經過乙醇梯度脫水、石蠟包埋、HE染色，制備成永久病理封片，通過顯微鏡觀察病理變化。

1.6.4尼氏體染色檢測神經元功能狀態 大鼠大腦組織石蠟切片常規脫蠟復水，蒸餾水沖洗3遍，玻片上滴加1%甲苯胺藍完全覆蓋腦組織，置于飽和水蒸氣的濕盒內。將濕盒放置于37℃溫箱內染色30 min。蒸餾水沖洗至流出水無明顯藍色，70%乙醇分色數秒至數分鐘，以細胞質僅為淺淡藍色終止分色。70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min梯度脫水，無水乙醇2次，每次5 min，二甲苯2次，每次10 min透明，中性樹膠封片隨機選擇10個200倍視野，計數尼氏體數量。

1.6.5實時熒光定量(RT)-PCR檢測Notch1、NICD和Hes1基因表達 分離缺血再灌注損傷大鼠海馬組織，用Trizol一步法提取總RNA；用M-MLV逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA；以cDNA為模板，β-actin為內參檢測Notch1、NICD和Hes1 3個基因的表達變化。

1.6.6Western印跡檢測Notch1、NICD和Hes1蛋白表達 分離局灶性缺血再灌注損傷大鼠海馬組織，提取總蛋白，以牛血清白蛋白作標準曲線，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。常規十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜，封閉后分別加入Notch1、NICD和Hes1的抗體和內參β-actin的抗體，孵育；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育；洗膜后用Western印跡熒光試劑激發熒光，顯示于X片，經顯影、掃描后用Image Pro Plus軟件進行顯影條帶的灰度值比較，以β-actin為內參，比較各組Notch1、NICD和Hes1 3個蛋白的相對表達量。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組神經功能缺損評分 除正常對照組外，造模成功，各組動物清醒后均出現不同程度的神經功能缺損。給藥14 d進行神經行為評分，與正常對照組比較，模型對照組評分明顯增加(P<0.05)；桑芪首烏片低、中、高劑量組及尼莫地平陽性藥物對照組評分也增加，但尼莫地平陽性對照組及桑芪首烏片高劑量組評分均明顯低于模型對照組(P<0.05)。給藥28 d，模型對照組評分進一步增加；尼莫地平陽性藥物對照組及桑芪首烏片中、高劑量組評分均明顯低于模型對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組神經行為評分及腦梗死灶大小比較

2.2各組腦梗死體積比較 除正常對照組外，其余各組均出現明顯的梗死灶。桑芪首烏片各劑量治療組及尼莫地平陽性對照組梗死灶明顯，但梗死范圍較模型對照組明顯減小，見圖1。經28 d藥物治療后，桑芪首烏片中、高劑量組、尼莫地平陽性對照組梗死灶體積、修正梗死灶體積和梗死率與模型對照組比較均明顯縮小(P<0.05)，見表1。

1～6：桑芪首烏片低、中、高劑量組、尼莫地平陽性對照組、模型對照組和正常對照組；圖5同圖1 各組腦梗死灶

2.3各組病理學改變 正常對照組細胞排列整齊，細胞核居中，核膜、核仁清晰；模型對照組細胞排列紊亂，細胞核碎裂、溶解、消失，出現大片紅染區域，細胞壞死明顯；尼莫地平陽性對照組及桑芪首烏片各劑量組細胞排列紊亂，但細胞壞死范圍明顯較模型對照組減小；且桑芪首烏片低、中、高劑量組細胞壞死數量與劑量呈負相關，見圖2。

圖2 各組腦梗死病理改變(HE染色，×400)

2.4各組尼氏體計數 正常對照組神經元細胞排列緊密，細胞形態完整，可見塊狀及顆粒狀尼氏體，數量較多。模型對照組神經元細胞胞質內尼氏體溶解消失，數量減少，與正常對照組比較差異顯著(P<0.05);桑芪首烏片低、中、高劑量組隨劑量增加，細胞形態明顯改善，尼氏體數量增加；3個劑量的桑芪首烏片組和尼莫地平陽性對照組與模型對照組比較，尼氏體數量顯著增加(P<0.05)，見圖3、表2。

2.5各組腦組織中Notch1、NICD和Hes1mRNA表達 模型對照組與正常對照組比較，Notch1、NICD和Hes1 3個基因表達均有增加，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。經28 d給藥治療，與模型對照組比較，桑芪首烏片中、高劑量組及尼莫地平陽性對照組3個基因表達均明顯增加(P<0.05)；桑芪首烏片低劑量組與模型組比較，3個基因表達雖有增加，但差異沒有統計學意義(P>0.05)，見表2、圖4。

2.6各組腦組織中Notch1、NICD和Hes1蛋白表達 與正常對照組比較，模型對照組Notch1、NICD和Hes1蛋白的表達水平均有增加，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，桑芪首烏片中、高劑量組及尼莫地平陽性對照組上述3個蛋白表達均明顯增加(P<0.05)；桑芪首烏片低劑量組與模型組比較，3個蛋白表達雖有增加，但差異沒有統計學意義(P>0.05)，見圖5、表3。

圖3 各組腦組織中尼氏體數量(尼氏體染色，×200)

表2 各組腦組織中尼氏體數量和局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Notch1、NICD及Hes1 mRNA相對表達比較

圖4 各組基因擴增曲線

圖5 各組局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中Notch1、NICD和Hes1蛋白表達

表3 各組Notch1、NICD及Hes1蛋白表達

3 討 論

腦缺血再灌注損傷引起神經元壞死或凋亡導致腦功能障礙，可引起不同程度的神經功能缺損癥狀，是引起患者致殘的重要原因。目前，無論是溶栓、介入、營養神經、康復訓練等均無法完全恢復患者的神經功能。因此，尋找更好的方法促進神經再生以替代受損的腦組織，改善患者的神經功能，提高患者的生活質量一直是國內外研究的熱點〔8〕。

神經干細胞(NSCs)是一種具有分化潛能和自我更新能力的母細胞，在生理狀態下多處于“靜息”狀態，在缺血或創傷性損傷刺激下，NSCs可被激活，分化成熟為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞，并遷移到特定的區域，替代并修復受損的神經元，一定程度上改善神經功能缺損。大量研究證實，內源性 NSCs 的增殖、遷移和定向分化，能改善腦缺血后的神經功能缺損癥狀〔9〕。然而內源性NSCs的增殖數量有限，不足以進行自我代償和修復。外源性NSCs移植又因為干細胞資源匱乏及移植后的免疫排斥反應等在臨床應用中受到諸多限制。因此，最大程度地促進內源性NSCs增殖、遷移、分化，恢復和重建神經功能成為目前研究的熱點〔10〕。

神經再生過程受到多種細胞信號通路和因子的調控，其中Notch信號通路是NSCs維持和自我更新的關鍵調節因子，與神經再生密切相關〔11～13〕。Yoon等〔14〕在研究小鼠大腦的母細胞時發現，在缺乏內源性和外源性的生長因子而僅有Notch信號通路時，就足夠支持NSCc的自我更新。陳娉婷等〔15〕研究發現通過調節Notch信號通路，上調Notch1、Notch2蛋白表達水平，可促進腦缺血再灌注大鼠神經功能恢復。Notch信號通路主要有Notch受體、Notch配體、轉錄因子及下游靶基因組成。當相鄰細胞間的Notch配體與受體結合后，引起受體多次水解釋放其胞內活性結構域(NICD)入核。NICD與轉錄因子結合，使其從轉錄抑制狀態變為激活狀態，啟動靶基因HES-1/HES-5等最終發揮生物學效應〔16〕。

Notch1是Notch受體中最重要的亞型，其在NSCs增殖中發揮著重要作用〔17〕。NICD是Notch受體的活性部分，是Notch信號活化的標志。Notch信號通路激活后主要通過Hes1轉錄因子促進NSCs增殖，維持其干性特征，當Hes1失活時，NSCs增殖抑制并向神經元方向分化〔18〕。Wang等〔19〕研究發現成年鼠在腦缺血缺氧后，神經干細胞的增殖過程中，NICD和HES1的表達水平增高，阻斷Notch通路后，NICD、HES1的表達減少，同時神經干細胞的增殖也明顯減少。房鈺鈔等〔20〕研究發現miR-155缺失可上調Notch1、NICD和Hes1表達，使神經元凋亡減輕。王俊杰等〔3〕研究表明地黃飲子能改善 MCAO 大鼠模型的神經功能缺損，減小腦梗死體積，減輕腦組織病理改變，可能與激活 Notch信號通路，上調 Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA 的表達，促進 NSCs 增殖有關。

腦缺血再灌注損傷屬“中風”范疇，國家級名老中醫陸家龍教授認為其恢復期病機多為本虛標實，以肝腎不足、氣血虧虛為本，以瘀血內停、痰濁阻絡為標〔21〕。“桑芪首烏方”能明顯改善腦梗死患者的中醫證候及偏癱肢體的運動功能，其總有效率高達85.29%；同時基礎研究也證實了該方能上調MCAO模型大鼠腦組織中腦源性神經生長因子及其受體酪氨酸激酶B的表達。本研究選取桑芪首烏片干預，方中桑寄生、首烏等補肝腎、益精血，配伍黃芪以益氣活血化瘀。諸藥合用，使肝有所補，腎有所滋，腦有所養，精血得旺，髓海得充，瘀去痰除，經絡通暢。