miR-1277-5p/UBASH3A在類風濕關節炎中的功能及其靶標驗證

宋建治 徐禮森

(武漢市第一醫院，湖北 武漢 430022)

類風濕關節炎(RA)是一種全身性自身免疫性疾病，以滑膜內膜明顯增生為特征，伴有嚴重的關節炎癥〔1,2〕。RA是一種慢性疾病，會導致關節損傷和功能障礙，并給患者帶來巨大的經濟和社會負擔〔3,4〕。RA的生物學發病機制仍未完全清楚。微小RNA(miRNA)在人類多種疾病中的重要調控功能已得到肯定，包括RA〔5,6〕，但仍有部分新發現的miRNA的功能需要探索。miR-1277-5p是一種近期在RA中發現的失調miRNA，其在RA中的功能尚未十分清楚。研究表明，含clip結構域的絲氨酸蛋白酶(UBASH)3A在多種自身免疫性疾病中起著關鍵作用，包括RA〔7〕。但是UBASH3A在RA中的功能及與miR-1277-5p之間的關系尚未清楚。本研究旨在探討miR-1277-5p、UBASH3A在RA中的功能及關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1～10月武漢市第一醫院確診的RA關節置換術患者3例，意外事故導致的截肢或關節粉碎的患者2例。患者及家屬均簽署知情同意書。胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；實時熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司；杜氏細胞培養基(DMEM)購自上海慧穎生物科技有限公司；細胞計數試劑盒(CCK)-8購自日本同仁化學研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海宇玫博生物。

1.2方法

1.2.1細胞分離培養 參照彭菲菲等〔8〕的方法，將正常滑膜組織和RA滑膜組織采用組織塊和酶消化法分離正常滑膜細胞和RA滑膜細胞，分別標記為正常組和RA組。將細胞使用DMEM培養基(10% FBS)進行常規的細胞培養、傳代，用5～7代的細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組 將分離培養的RA滑膜細胞標記為RA組、對照組，并將其隨機分為miR-NC組、miR-1277-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-1277-5p組、pcDNA組、pcDNA-UBASH3A組、si-NC組、si-UBASH3A組、miR-1277-5p+pcDNA組、miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組、anti-miR-1277-5p+si-NC組、anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組。各組細胞均按1：3的量加入脂質體將相應的質粒或DNA進行轉染。miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-1277-5p組(轉染miR-1277-5p mimics)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-1277-5p組(轉染anti-miR-1277-5p)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-UBA-SH3A組(轉染pcDNA-UBASH3A)、si-NC組(轉染si-NC)、si-UBASH3A組(轉染si-UBASH3A)、miR-1277-5p+pcDNA組(共轉染miR-1277-5p mimics和pcDNA)、miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組(共轉染miR-1277-5p mimics和pcDNA-UBASH3A)、anti-miR-1277-5p+si-NC組(共轉染anti-miR-1277-5p和si-NC)、anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組(共轉染anti-miR-1277-5p和si-UBASH3A)，轉入RA滑膜細胞，轉染48 h，用qRT-PCR確認轉染成功后用于后續實驗研究。

1.2.3qRT-PCR 收集待檢測的細胞，提取總RNA，并將其反轉錄為cDNA，-20℃保存、備用。用qRT-PCR試劑盒檢測樣本中的miR-1277-5p、UBASH3A mRNA表達。結果以U6、GAPDH為內參，2-△△Ct法計算miR-1277-5p、UBASH3A的表達水平。miR-1277-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAATATATATATATATGT-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；UBASH3A上游引物5′-GGA CTTGCACGACTAA-3′， 下游引物5′-CCGT-ACGTCAATTGAC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCG T-3′；GAPDH上游引物5′-CTCTGCTCCTCCTGTTC GAC-3′，下游引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。

1.2.4Western印跡實驗 將需要檢測的細胞裂解、提取總蛋白并定量和變性，用上清液進行蛋白電泳上樣。用5%的分離膠和8%的濃縮膠進行電泳，再用轉膜儀將蛋白從膠上轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，最后用2.5%脫脂奶粉封閉2 h。行一抗(1∶1 500)4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。用超敏電化學(ECL)發光試劑盒進行顯影曝光。以目的條帶灰度與內參條帶灰度的比值表示蛋白的表達水平。

1.2.5CCK-8實驗 將需要檢測的細胞調整至105個/ml，按照CCK-8試劑盒要求操作，取適量細胞加入CCK-8溶液反應，終止反應后，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞增殖率為A490樣本/A490對照×100%。

1.2.6流式細胞術 先將需要檢測的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，重懸，再用結合緩沖液將細胞懸浮。然后按照Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒要求操作，加入Annexin V-FITC、PI，避光反應15 min，結束后，快速上流式細胞儀進行結果檢測分析。細胞凋亡率為Annexin V-FITC陽性率與PI陽性率之和。

1.2.7生物信息學預測 使用生物信息學在線預測網站mircode(http://mircode.org/)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn)預測與UBASH3A存在結合位點的miRNA，從中篩選保守的miRNA。另一方面結合NCBI中上傳的RA相關的差異miRNA表達譜分析，確定miRNA。

1.2.8雙熒光素酶報告實驗 首先通過化學合成野生型UBASH3A片段(UBASH3A-WT)和突變型UBASH3A片段(UBASH3A-MUT)，再將其克隆至psiCHECK2載體，構建熒光素酶報告載體并提取質粒。用8倍質粒量的脂質體將miR-NC、miR-1277-5p、anti-miR-NC、anti-miR-1277-5p分別與psiCHE CK2-UBASH3A-WT、psiCHECK2-UBASH3A-MUT共轉染48 h。用雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測所處理細胞的熒光素酶活性。測量螢火蟲熒光素酶的活性(F)，在測量海腎熒光素酶熒光強度(R)，結果以二者的比值(R/F)表示。

1.3統計學方法 采用PEMS3.2軟件進行單因素方差分析、LSD-q檢驗、t檢驗。GraphPad Prism6.0進行相關圖片的繪制。

2 結 果

2.1各組miR-1277-5p、UBASH3A水平比較 與對照組關節滑膜細胞相比，RA組關節滑膜細胞中miR-1277-5p表達水平明顯降低，UBASH3A mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。見圖1和表1。

2.2miR-1277-5p對RA滑膜細胞增殖、凋亡的調控 與miR-NC組相比，miR-1277-5p組RA滑膜細胞miR-1277-5p mRNA表達水平明顯升高，細胞增殖率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，增殖細胞核抗原(PCNA)、凋亡抑制蛋白(XIAP)表達水平明顯降低，P16、裂解DNA修復酶(cleaved-PARP)蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1277-5p組RA滑膜細胞miR-1277-5p mRNA表達水平明顯降低，細胞增殖率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，PCNA、XIAP蛋白表達水平明顯升高，P16、cleaved-PARP蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2、圖3。

圖1 UBASH3A在RA滑膜細胞中表達

表1 各組miR-1277-5p、UBASH3A表達

圖2 miR-1277-5p對RA滑膜細胞凋亡的調控

表2 miR-1277-5p對RA滑膜細胞增殖、凋亡的影響

1～5：對照組,miR-NC組，miR-1277-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-1277-5p組圖3 RA滑膜細胞增殖凋亡相關蛋白的表達

2.3miR-1277-5p靶向UBASH3A 生物信息學預測結果見圖4，miR-1277-5p與UBASH3A之間存在連續的7個核苷酸互補結合位點。與miR-NC組相比，miR-1277-5p組UBASH3A-WT細胞熒光素酶活性明顯降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1277-5p組UBASH3A-WT細胞熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)。miR-1277-5p負向調控UBASH3A蛋白表達水平(P<0.05)。見圖5和表3。

圖4 miR-1277-5p與UBASH3A之間的結合位點

1～4：miR-NC組，miR-1277-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-1277-5p組圖5 miR-1277-5p調控UBASH3A蛋白表達

表3 miR-1277-5p直接調控

2.4UBASH3A對RA滑膜細胞增殖、凋亡的調控 與pcDNA組相比，pcDNA-UBASH3A組RA滑膜細胞UBASH3A mRNA表達水平明顯升高，細胞增殖率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，PCNA、XIAP蛋白表達水平明顯升高，P16、cleaved-PARP蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-UBASH3A組RA滑膜細胞UBASH3A mRNA表達水平明顯降低，細胞增殖率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，PCNA、XIAP蛋白表達水平明顯降低，P16、cleaved-PARP蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖6、表4、圖7。

圖6 UBASH3A處理的RA滑膜細胞凋亡

表4 UBASH3A對RA滑膜細胞增殖、凋亡的調控

1～4：pcDNA組，pcDNA-UBASH3A組，si-NC組，si-UBASH3A組圖7 UBASH3A處理的RA滑膜細胞增殖、凋亡相關蛋白表達

2.5過表達UBASH3A部分逆轉miR-1277-5p對RA滑膜細胞增殖、凋亡的作用 與miR-1277-5p+pcDNA組相比，miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組RA滑膜細胞miR-1277-5p mRNA表達水平明顯降低，細胞增殖率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，PCNA、XIAP蛋白表達水平明顯升高，P16、cleaved-PARP蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖8、圖9、表5。

圖8 過表達UBASH3A和miR-1277-5p處理的RA滑膜細胞凋亡圖

1，2：miR-1277-5p+pcDNA組,miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組圖9 Western印跡檢測PCDNA、P16、XIAP、cleaved-PARP水平

表5 過表達UBASH3A部分逆轉miR-1277-5p對RA滑膜細胞增殖、凋亡的調控

2.6抑制UBASH3A逆轉anti-miR-1277-5p對RA滑膜細胞增殖、凋亡的作用 與anti-miR-1277-5p+si-NC組相比，anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組RA滑膜細胞miR-1277-5p mRNA表達水平明顯升高，細胞增殖率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，PCNA、XIAP蛋白表達水平明顯降低，P16、cleaved-PARP蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見表6、圖10、圖11。

表6 抑制UBASH3A逆轉anti-miR-1277-5p對RA滑膜細胞增殖、凋亡的作用

圖10 抑制UBASH3A和miR-1277-5p處理的RA滑膜細胞凋亡

1，2：anti-miR-1277-5p+si-NC組,anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組圖11 抑制UBASH3A和miR-1277-5p處理的RA滑膜細胞增殖、凋亡相關蛋白電泳

3 討 論

研究證實miRNA在RA中具有重要作用〔5,9〕。Crowe等〔10〕報道，miR-1277-5p是人骨關節炎(OA)軟骨細胞中異常下調的miRNA之一。Wang等〔11〕研究顯示，miR-1277-5p可同時靶向長鏈非編碼RNA X失活特異性轉錄本(XIST)、基質金屬蛋白酶(MMP)-13和血小板反應蛋白1型基序5的ADAM金屬肽酶(ADAMTS5)參與OA發展，具體為XIST通過在OA中起miR-1277-5p的競爭性內源RNA(ceRNA)的作用來促進MMP-13和ADAMTS5表達，促進細胞外基質(ECM)降解。本研究結果說明miR-1277-5p在RA滑膜細胞的增殖、凋亡中具有關鍵作用。進一步研究發現，miR-1277-5p還可靶向UBASH3A，這可能與miR-1277-5p在RA中的功能具有聯系。研究在韓國和歐洲人群中通過全基因組分析發現兩個新的RA易感基因(UBASH3A和SYNG-R1)〔12〕。Liu等〔13〕研究中也報道，UBASH3A與RA患者的疾病嚴重程度具有緊密相關性。Yang等〔14〕研究發現，RA患者的 外周血單核細胞(PBMC)中UBASH3A的mRNA表達異常增加，揭示UBASH3A失調可能與RA的發病有關，并且UBASH3A基因多態性(rs1893592和rs3788013)可能導致中國漢族人群RA的易感性。本研究結果說明UBASH3A在RA中的失調，確實具有促進RA病情發展的作用；UBASH3A能夠恢復miR-1277-5p在RA滑膜細胞增殖、凋亡中的作用。這些結果為miR-1277-5p、UBASH3A在RA中的功能探索奠定基礎。