大鼠BMSCs經同種異體軟骨細胞體外非接觸共培養誘導成軟骨組織

江祖炘 汪春秀 王躍

(1宜賓市第二人民醫院 四川大學華西醫院宜賓醫院，四川 宜賓 644000；2四川省人民醫院)

隨著中國進入老齡化社會，關節軟骨損傷的患者越來越多，特別是老年骨關節炎患者，關節軟骨由于解剖原因自身無血管、淋巴組織，缺乏必要的營養供給，且成熟的軟骨細胞再分化增殖能力差，所以一旦損傷后自我修復困難，進而可發展為骨關節炎，嚴重影響日常生活〔1，2〕。近年新興的軟骨組織工程技術，提供了一種解決傳統關節軟骨修復方法取材不足、增加創傷、遠期效果不佳等問題的方法〔3，4〕。本研究旨在探討骨髓間充質干細胞(BMSCs)復合改良纖維蛋白凝膠和軟骨細胞體外非接觸共培養向軟骨組織分化，獲取優秀的種子細胞，同時可注射微創下修復關節軟骨缺損的可能方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑及方法 清潔級3～5 d SD大鼠乳鼠4只(四川大學華西醫院動物實驗中心)；L-DMEM培養基(GIBCO公司)；胎牛血清(FBS，HyClone公司)；胰蛋白酶(Trypsin，GIBCO公司)；Ⅱ型膠原酶(GIBCO公司)；兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)；逆轉錄試劑盒、cDNA 試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳試劑盒(DNA Marker)、綠如藍低毒核酸(DNAgreen)染料、凝膠加樣緩沖液均購自天根公司。

1.2SD大鼠股骨BMSCs的獲取、培養、鑒定 取3～5 d SD大鼠乳鼠處死后，于超凈工作臺內，注射器吸取0.5 ml L-DMEM培養基用力沖洗股骨髓腔，將沖洗液反復吹散后轉移至25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，傳代，鏡下觀察，取第3代(P3)BMSCs復合支架后行蘇木素-伊紅(HE)染色及甲苯胺藍染色。

1.3SD大鼠膝關節軟骨細胞的獲取、培養、鑒定 取3～5 d SD大鼠乳鼠處死后，于超凈工作臺內，獲取股骨遠端和脛骨近端關節軟骨，將剪碎的軟骨組織依次0.25%的胰蛋白酶及0.2%Ⅱ型膠原酶消化，離心后獲取軟骨細胞，將軟骨細胞接種于25 cm2培養瓶中培養，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，傳代，鏡下觀察，取P1軟骨細胞復合支架后行Ⅱ型膠原免疫組化染色、HE染色及甲苯胺藍染色。

1.4改良纖維蛋白凝膠支架-細胞復合物制備 將P3 BMSCs加入0.9% NaCl配制的含50 mg/L的纖維蛋白原溶液，并使細胞懸液濃度為2×106/ml。再配制凝血酶復合液：凝血酶(50 μ/ml)、抑肽酶(0.2 mg/ml)、氨甲環酸(20 mg/ml)、氯化鈣(40 mmol/L)。向24孔培養板中每孔先加入凝血酶復合液250 μl，再加入改良的纖維蛋白細胞懸液250 μl，然后放入37℃、CO2孵箱，3～5 min后，支架凝固成型。

1.5實驗分組 將制備的凝膠支架-細胞復合物置于Transwell共培養系統中的下室，P1軟骨細胞接種于Transwell共培養系統中的上室，BMSCs和軟骨細胞體外按細胞數比例2∶1非接觸共培養作為實驗組(B組)；分別用第1代(P1)軟骨細胞和P3 BMSCs按上述方法與改良纖維蛋白膠凝膠支架材料復合，分別體外培養作為陽性對照(A)組和陰性對照(C)組，調整細胞數量，使3組細胞-支架復合體內細胞總數相同。使用10%FBS 的L-DMEM培養基培養。

1.6樣本采集及成軟骨組織能力檢測 標本大體觀察及重量比較、HE和甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色。阿利新藍比色法檢測蛋白聚糖(GAG)含量，RT-PCR法半定量檢測Ⅱ型膠原mRNA表達檢測。

1.7統計學分析 采用SPSS19.0軟件行LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1BMSCs、軟骨細胞倒置相差顯微鏡觀察 原代BMSCs 48 h換液時見部分貼壁生長，呈不均勻狀菌落分布，部分細胞邊緣出現突起，長短粗細不一，可見梭形狀、少量多角形細胞，傳代生長過程中細胞形態逐步相同，胞質內顆粒增多(圖1)。原代軟骨細胞未貼壁時呈球形，約1 d后完全貼壁，傳代后5～6 h即可見貼壁生長，4 d左右即可完全長滿培養瓶，細胞片狀增殖，可見典型軟骨細胞“蜂巢”樣改變(圖2)。

2.23組重量比較分析 C組重量與A組、B組差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.3GAG含量測定 B組與A組GAG含量差異無統計學意義(P>0.05)，C組GAG含量明顯低于A組和B組(P<0.05)。見表1。

圖1 原代BMSCs培養2 d后鏡下觀察(×40)

圖2 原代軟骨細胞4 d鏡下觀察(×40)

2.43組標本肉眼觀察 A組和B組肉眼觀察見標本體積較大，形態相對飽滿圓潤，能維持凝膠支架合成時的形狀，標本內可見類似軟骨組織樣的膠凍狀半透明物質沉積，韌性較好；C組標本凝膠支架變形，部分分解，形狀不規則，韌性較差。見圖3。

2.5各組HE和甲苯胺藍染色結果 A組和B組標本中皆可見軟骨細胞分布，活性良好，且可見明顯的細胞外基質環繞，染色后的細胞成典型的蜂巢樣結構，而C組標本染色只能見到梭形的BMSCs細胞及少量的細胞外基質。見圖4。

表1 3組標本重量、GAG含量及Ⅱ型膠原蛋白mRNA比較

2.6標本Ⅱ型膠原免疫組化染色結果 A組和B組標本內皆為典型的軟骨細胞染色后反應，胞核為藍色，部分顏色較深，余細胞及胞外組織有均勻分布的棕色顆粒。而C組可見細胞核染色外，余未見明顯染色物質。見圖5。

2.7標本Ⅱ型膠原mRNA表達檢測 A組和B組Ⅱ型膠原mRNA的表達無明顯差異(P>0.05)，A組與B組均顯著高于C組(P<0.05)，見表1、圖6。

圖3 6 w各組肉眼觀察標本形態

圖4 各組6 w HE染色及甲苯胺藍染色(×400)

圖5 各組6 w免疫組化染色(×400)

圖6 目的基因PCR凝膠電泳

3 討 論

關節軟骨自身解剖結構特異及成熟軟骨細胞再分化能力差，因而關節軟骨損傷后修復是一個極其復雜且困難的過程，目前自體軟骨移植技術在修復效果上較佳，但其自體軟骨來源有限，另外傳統的有創手術如微骨折也是一種方法，但增加創傷的同時遠期修復效果也不理想〔3，4〕。組織工程技術的出現為組織的修復再生提供了一種新的可能〔5〕，組織工程中種子細胞的選擇及體外培養是目前需要攻克的難點，也是目前研究的熱點。BMSCs因其取材容易，來源廣，有良好的多向分化潛能及優秀的增殖能力使其成為組織工程中種子細胞的熱門“選手”，但存在體外定向誘導分化過程復雜，誘導生成的軟骨細胞表型不穩定，軟骨組織質量不佳等問題〔6，7〕。同時自體軟骨細胞體外擴增后再回植修復缺損軟骨已取得較好效果〔8〕，但其自體軟骨來源有限，限制了其進一步的研究?；谏鲜鰡栴}，本實驗將少量的軟骨細胞與BMSCs體外共培養作為種子細胞，以希望優勢互補，克服單一種子細胞來源不足、易去分化、難于精確誘導等缺點。Liu等〔9〕將BMSCs注入股骨頭壞死關節軟骨缺損的動物模型中在軟骨缺損部位檢測到有透明軟骨形成，這可能是由于關節軟骨組織能提供BMSCs向軟骨細胞方向分化的微環境〔10〕，且骨關節炎軟骨細胞較正常軟骨誘導BMSCs成軟骨分化能力弱〔11〕。Acharya等〔12〕研究表明BMSCs和軟骨細胞體外非接觸共培養后，一定比例的軟骨細胞可分泌類似成軟骨誘導培養基的細胞液，提供成軟骨誘導微環境，誘導BMSCs向軟骨細胞分化，并能形成類似新生軟骨組織。且軟骨細胞和干細胞隔離共培養較混合共培養有更多的蛋白聚糖的積累〔13〕。至于共培養細胞最好比例目前無一致結論〔14〕，謝鵬等〔15〕通過關節軟骨細胞和BMSCs按1∶2比例共培養后發現該比例能更好地表達Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白基因，能更好維持軟骨細胞表型，故本實驗采用關節軟骨細胞和BMSCs按1∶2比例非接觸共培養進行研究。

細胞復合支架后能很好地模擬體內軟骨細胞三維的空間分布，更有利于軟骨細胞表型的維持，有利于軟骨細胞外基質的分泌與分布〔16〕。種子細胞體外培養其支架的選擇也是組織工程中不可或缺的部分，所以本研究將BMSCs先與支架復合后，讓細胞分布在三維空間的支架中，再放入Transwell共培養系統與自體軟骨細胞共培養，更好的模擬軟骨自身修復過程。黃亮節等〔17〕研究表明纖維蛋白凝膠支架內的三維結構對于干細胞的成軟骨分化的能力是優于Pellet培養體系的，可能由于纖維蛋白凝膠的三維孔隙結構更接近于正常的軟骨組織，細胞因子之間交互更充分〔18〕，同時纖維蛋白可釋放血小板生成因子及轉化生長因子(TGF)-β〔19〕，進一步促進軟骨組織的形成。Komárek等〔20〕將組織工程軟骨以纖維蛋白凝膠固定于軟骨下骨，修復關節軟骨缺損，92.3%獲得了滿意效果。但一般的纖維蛋白凝膠降解時間相對較快，不能較好地匹配軟骨細胞外基質的形成速度，影響最終形成的軟骨組織。故本實驗采用的改良纖維蛋白凝膠支架，其降解速度和新生軟骨形成速度基本匹配，從而形成的新生軟骨組織特性更接近正常軟骨組織〔21〕。同時該支架在形成階段為凝膠狀態，可以通過關節鏡微創技術體外注入需要行軟骨修復的地方，為微創治療軟骨缺損提供了新的思路。

本研究結果發現，A組和B組的標本外觀形態維持較好，而C組隨著支架的分解不能維持較好形態，且A組和B組標本內可看見類似軟骨組織樣的膠凍狀半透明物質沉積，組織學切片染色同樣顯示A組和B組標本中皆為軟骨形態樣細胞及軟骨組織特有的陷窩樣改變，其中值得注意的是B組標本中未見到梭形的BMSCs，可能是實驗組細胞不僅通過共培養后成功被誘導形成軟骨細胞，原有的BMSCs全部消失〔22〕，同時也分泌了細胞外基質維持了標本形態。此外細胞外蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的分泌對新生軟骨組織的形成亦十分重要。陳剛等〔23〕研究表明共培養組的Ⅱ型膠原表達及糖胺聚糖含量均優于對照組。本研究結果說明BMSCs復合支架與軟骨細胞共培養后能向軟骨細胞分化和分泌細胞外基質，同時可能誘導生成的軟骨細胞活性較分化成熟的軟骨細胞高。標本Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色及RT-PCR測定Ⅱ型膠原mRNA的結果也與上述推斷吻合。

綜上，將BMSCs和少量的軟骨細胞共培養后可以作為一種更為優秀的組織工程種子細胞，且纖維蛋白凝膠支架的可塑性，為以后可注射式微創軟骨修復組織工程提供可能方法。不足之處，兩種細胞共培養的最優比例、該方法的體內研究及最終軟骨修復的效果還需進一步研究。