牛膝-續斷治療股骨頭壞死的作用機制*

李金宗，侯德才，鞏雪

1 遼寧中醫藥大學研究生學院 遼寧沈陽 110032 2 遼寧中醫藥大學附屬醫院 遼寧沈陽 110032

股骨頭壞死（Osteonecrosis of the Femoral Head，ONFH）為難治性疾病，因其高度致殘性之因引發越來越多的人群關注[1]。對于本病，保髖治療作為一種重要治療方法一直以來備受青睞[2]?！饵S帝內經》有言：“不治已病治未病?！敝嗅t藥向來遵循整體觀念和辨證論治這個基本出發點，對方藥和疾病的關系研究較少，因而探尋其藥物應用在本病中存在重要研究價值。如今，隨著中醫藥的日益發展，通過數據網絡在系統生物學的理論基礎上，聚焦所需要研究的蛋白、基因和通路，能夠更加準確合理地指導中藥在臨床治療中的運用[3]。并且“牛膝—續斷”作為活血化瘀法治療股骨頭壞死的常用藥物[4]，牛膝是莧科植物川牛膝的干燥根，產自四川。味苦、甘、酸，性平，歸肝、腎經。牛膝味苦泄降，“走而能補，性善下行”，在活血化瘀的同時能通利關節、引血下行，而善治下焦瘀血證[5]。而續斷具有補肝腎，強筋骨，續折傷的功效[6]。故而運用網絡藥理學及分子對接技術探尋其蛋白靶點效應關系及對股骨頭壞死治療作用機制有重要研究價值。故而采用此方法以達到探尋及了解其藥物成分與疾病靶點之間的具體關系預測，從而為進一步臨床觀察研究及動物實驗研究提供具體方向性指導。

資料與方法

1 活性成分及靶點篩選

以“牛膝”“續斷”為關鍵詞，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/index.php） 的ADME（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion）功能，以口服生物利用度OB大于30%、類藥性DL＞0.18 為篩選標準獲得活性成分，并預測其靶點信息。通過Uniprot 數據庫（https：//www.u-niprot.org/）搜索靶點相對應的人類基因，進行信息匯總。

2 檢索已知的股骨頭壞死靶點

在GeneCards 數 據 庫（https：//www.genecards.org/）中，以“ANFH”“AVN”“ONFH”“osteonecrosis of the femoral head”及“femoral head necrosis”為搜索詞，檢索出與股骨頭壞死相關的疾病靶點。

3 篩選藥物-疾病共同靶點

利用R 語言4.1.2 獲得牛膝-續斷與股骨頭壞死共同靶點，于Venny2.1 在線平臺構建韋恩圖進行可 視化。

4 牛膝-續斷治療股骨頭壞死的蛋白間相互作用

使 用String 數 據 庫（https：//cn.string-db.org/）PPI 分析功能處理共同靶點，選擇物種為“人類”、置信度＞0.4，隱藏離散點，其余設置默認，獲得可以展示蛋白相互作用的PPI 網絡，從而明確牛膝-續斷藥對與股骨頭壞死共同靶點蛋白間的相互作用。運用Cytoscape3.8.2 對PPI 網絡進行美化，并且篩選出核心靶點。

5 共同靶點GO 及KEGG 富集分析

利用R 語言4.1.2 及org.Hs.eg.db 等相關程序包，對潛在共同靶點的生物過程（bio-logical process）、細 胞 組 分（cell component）、分 子 功 能（molecular function）這3 個方面分別富集分析，選擇每項前10繪制可視化柱狀圖。選擇KEGG 富集分析前20 條進行可視化。從而探究牛膝-續斷藥對治療股骨頭壞死的可能潛在作用機制。運用Cytoscape3.8.2 繪制“中藥-靶點-疾病-通路”網絡圖，并對其進行網絡拓撲結構的分析，按照 Degree 值大小篩選排名靠前的活性成分作為核心成分。

6 分子對接

于PubChem 數 據 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載牛膝- 續斷核心成分的2D 結構，作為 配 體。于PDB 數 據 庫（https：//www.rcsb.org/）下載PPI 獲得的核心基因相關蛋白結構，作為受體。在Pymol 軟件對受體蛋白去水、加電荷、加氫。配體及受體均需在AutoDock1.5.6 更改為pdbqt 格式。運用Pymol 獲得對接盒子xyz 坐標軸參數，輸入Autodock-Vina 開始分子對接，這時計算機CPU 運算得出最低結合能。PyMol 獲得的受體與配體結合的復合物，導入PLIP 平臺進行分析，使用PyMol 對最佳分子對接模式進行可視化。

結果

1 牛膝-續斷活性成分及靶點篩選結果

依照上述篩選標準，去重后共得出牛膝-續斷藥對27 種活性成分及202 個靶基因，見表1。

2 股骨頭壞死靶點獲取結果

選取國際公認的GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）中，去重得出股骨頭壞死聯系密切的已知潛在靶點2302 個。

3 藥物與疾病的共同靶點獲取

通過R 語言得到共同靶點125 個，于Venny2.1在線平臺繪制韋恩圖。見圖1。

4 藥物-疾病交集靶點的PPI 網絡構建及核心靶點篩選

依照上述標準，使用String 數據庫PPI 分析功能處理共同靶點，刪除1 個離散節點，選擇tsv 格式文件下載，并且導入Cytoscape3.8.2 構建PPI 網絡圖。見圖2。PPI 關系互作圖包括124 個節點和2484 條邊，利用CytoNCA 插件拓撲結構分析，根據接近中心性CC、借助度中心性DC、介度中心性BC、局部邊連通性LAC 和網絡中心性NC、特征向量中心性EC 這6 個指標，以大于中位數為標準，進行3 次計算分析，過程見圖3。獲得5 個核心基因，分別是AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN。見表2。

表2 核心基因

圖2 PPI 網絡圖

圖3 PPI 網絡核心基因篩選流程圖

5 GO 靶點通路分析結果

GO 富集分析表明，牛膝-續斷治療股骨頭壞死靶點影響了2047 個生物學過程，43 個細胞組分，128個分子功能。BP 主要涉及對脂多糖的反應、對細菌源分子的反應、對異種刺激的反應、對營養水平的反應。對類固醇激素的反應、對活性氧的反應、傷口愈合、對氧化應激的反應、對輻射的反應、細胞對化學脅迫的反應等；CC 主要與膜筏、膜微域、凹陷、水泡腔、質膜筏、分泌顆粒管腔、胞質小泡腔、轉錄調節復合體、富含無花果-1 的顆粒管腔、細胞器外膜等相關；MF 主要涉及DNA 結合轉錄因子結合、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結合轉錄因子結合、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、轉錄共激活因子結合、細胞因子受體結合、轉錄輔助調節因子結合、類固醇激素受體活性、血紅素結合、四吡咯結合等。選取富集結果每項顯著性前10 繪制柱狀圖，展示GO 功能與其涉及基因數的對應關系。見圖4。

圖4 GO 富集分析

6 KEGG 富集分析結果

共同靶點KEGG 富集分析（P＜0.05）得到通路165 條，富集比較明顯的前20 個通路包括：脂質與動脈粥樣硬化、晚期糖基化終產物及其受體AGE-RAGE信號通路、流體切應力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、乙肝、前列腺癌、腫瘤壞死因子信號通路、人巨細胞病毒感染、丙型肝炎、化學致癌-受體激活、小細胞肺癌、膀胱癌、恰加斯病、胰腺癌、麻疹、甲型流感、缺氧誘導因子-1 信號通路、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、弓形蟲病等。見圖5。

圖5 KEGG 富集分析

7 “中藥-靶點-疾病-通路”網絡圖

將KEGG 富集分析篩選出的20 條信號通路，運用Cytoscape3.8.2 分析“中藥- 靶點- 疾病- 通路”相互作用網絡。該網絡包括286 個節點和1080 條邊，利用CytoNCA 插件拓撲結構分析，Degree 值越大網絡中的節點越大。見圖6。并按照 Degree 值大小篩選出排名前5 的活性成分作為牛膝-續斷的核心成分。見表3。

圖6 “中藥-靶點-疾病-通路”網絡圖

表3 Degree 值排名前5 的活性成分

8 分子對接分析結果

選擇核心成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素作為小分子配體，選擇核心基因AKT1（PDB 2Z25）、TNF（PDB 2Z25）、IL6（PDB 1ALU）、TP53（PDB 4MZI）、JUN（PDB 1JNM）作為受體，進行虛擬分子對接。研究表明，結合能為負數時配體與受體不需要外界助力即可結合，并且結合能的數值越低，對接模式越穩定。見表4。結果可知，槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素與AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN 這5 個靶點能形成穩定氫鍵，且結合能均為負數，表明牛膝-續斷治療股骨頭壞死效果頗佳。對結合能均低于-10kJ/mol 的6 種對接模式，使用PyMol 軟件進行可視化。見圖7。

圖7 分子對接模式圖

表4 牛膝-續斷核心成分與靶點的結合情況

討論

股骨頭壞死與血液紊亂、代謝和凝血障礙有關[7]。在中醫理論中雖無本病名稱，但是發病癥狀及體征判斷可與中醫學中“骨痹”相吻合。因而中醫理論對本病的臨床治療指導作用毋庸置疑。王均玉等[8]通過經筋理論對股骨頭壞死的癥狀進行對癥干預，以促進局部血液循環實現良好治療目的。張濤等[9]從血瘀理論出發，運用骨蝕方以及配合蛙泳姿勢對股骨頭壞死早期干預達到良好效果。這說明中醫學中“血瘀”理論與本病關系極其密切。因而探討牛膝-續斷藥對對于活血化瘀方法干預股骨頭壞死，其理論對臨床有重要指導價值。

中藥藥對“牛膝—續斷”與股骨頭壞死疾病取共同交集，結果發現共同靶點數為125 個，說明此藥對存在股骨頭壞死相關干預作用機制。文獻研究顯示，長期小劑量應用或短期大劑量應用糖皮質激素均可通過影響ROS/JNK/c-Jun 通路相關作用誘導大鼠股骨頭壞死[10]。又PRP-Exos 可通過介導Akt/Bad/Bcl-2 信號通路來抑制糖皮質激素相關內質網應激，從而誘導股骨頭壞死大鼠的細胞凋亡[11]。已有研究表明，股骨頭缺血性壞死患者血清和骨組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平高于正常人，提示TNF-α 可能在股骨頭壞死的發病機制中起一定作用。其研究數據顯示，與健康患者相比，股骨頭缺血性壞死患者骨組織中TNF-α 表達顯著上調，并且明顯激活了p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）信號通路。文獻顯示，雖然有部分p38mapk/NF-κB 通路的抑制顯著減弱了TNF-α誘導的自噬，但增強了TNF-α 誘導的成骨細胞凋亡。股骨頭壞死患者體內TNF-α 增加，通過p38-MAPK/NF-κB 信號通路調節成骨細胞自噬和凋亡，進而抑制自噬流量阻斷該通路，從而加劇TNF-α 誘導的凋亡[12]。TP53 也與細胞凋亡密切相關。股骨頭壞死患者骨髓以及成骨細胞凋亡，導致股骨頭頭部出現塌陷，頭部與髖臼連接的圓形表面變平，最終引發繼發性骨關節炎[13]。IL6 與炎癥反應密切相關，是細胞因子網絡的主要參與者[14]，可參與調節免疫應答，造血，急性期反應和炎癥反應等相關生物過程[15]。而股骨頭壞死最終伴隨骨性關節炎[16]，因而與IL6 的參與密不可分。

本次研究顯示，“中藥-靶點-疾病-通路”調控網絡中含有最多相關靶基因的有效成分分別為槲皮 素（Quercetin）、β- 谷 甾 醇（Beta-sitosterol）、山柰酚（Kaempferol）、漢黃芩素（Wogonin）以及黃芩素（Baicalein）。其中，槲皮素（Quercetin）為一種從植物中提取的多酚，其擁有包括抗炎在內等多種生物學作用[17]。山柰酚（Kaempferol）為膳食類生物黃酮之一，通過抑制脂肪形成、炎癥反應、氧化應激，拮抗破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡，激活成骨細胞自噬，從而實現骨保護作用[18]，對股骨頭壞死在內的骨性關節炎有良好干預。并且漢黃芩素（Wogonin）和黃芩素（Baicalein）也可抗氧化，抗炎和抗細胞凋亡，對缺血性疾病也有良好干預作用[19]。

KEGG 分析結果顯示，脂質與動脈粥樣硬化，IL-17 信號通路，腫瘤壞死因子信號通路，流體切應力與動脈粥樣硬化，缺氧誘導因子-1 信號通路為主要信號通路。根據文獻研究結果顯示，導致動脈粥樣硬化所相關的脂質代謝異常的危險因素，包含股骨頭壞死在內的多種疾病[20]。這也正如中醫理論中所言，營氣為濡養全身的重要物質，是化生血的主要來源。又因氣為血之帥，而統領血行；而血為氣母，濡養一身之氣，二者相關密不可分。氣屬無形而血屬有形，形者為精微物質即氣血的最終客觀形體存在，骨為精所化，髓乃精所生，氣血不暢則精無生而骨乃壞也。內皮細胞將血液流動的摩擦力（流體剪切力）轉化為生物化學信號，通過特殊的機制和途徑調控基因表達和細胞行為。這些通路在發育期間、出生后和成年時期塑造血管系統，以優化流向組織的流動。這些途徑也會導致動脈粥樣硬化和血管畸形[21]，導致局部血流變化甚至血流量減少，而股骨頭周圍血流量及局部血流的減少，被認為是發病的重要原因之一[22]。同時腫瘤壞死因子TNF 在炎癥、細胞凋亡、細胞增殖和免疫系統刺激等方面也是發揮著重要的多效性作用[23]。

通過分子對接發現，核心成分槲皮素、β- 谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素與核心蛋白AKT1、TNF、IL6、TP53、JUN 的結合能均為負數。說明核心成分可以自動結合核心蛋白，并且發揮作用，通過介導激活或抑制其相關通路，達到對股骨頭壞死的干預作用。

綜上所述，中藥“牛膝-續斷”藥對中包括山奈酚在內的多種化學成分可對股骨頭壞死發病進行多成分，多靶點，多通路的干預治療。尤其通過山奈酚介導其脂質與動脈粥樣硬化，流體切應力與動脈粥樣硬化通路以達到恢復股骨頭周圍血運能力，達到從瘀來論治本疾病。本研究對臨床治療股骨頭壞死的作用機制具有借鑒意義，同時也為更臨床應用提供了理論支撐。但由于數據庫信息不全面、藥材成分差異等問題，結論仍待進一步實驗和臨床研究驗證。