辣木花部特征、花粉活力及柱頭可授性分析

普天磊，韓學(xué)琴，廖承飛，羅會(huì)英，何 璐，鄧紅山，范建成，金 杰

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所/元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300）

辣木（Moringa oleiferaLam.）為辣木科辣木屬的多年生落葉喬木，共有13個(gè)種，生長速度快，種植6個(gè)月即可開花結(jié)果，產(chǎn)量高，適應(yīng)性強(qiáng)，在熱帶、亞熱帶地區(qū)均可種植［1-2］。辣木全株富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分［3］，黃酮、多酚、多糖、異硫氰酸酯、生物堿、萜類等功效成分，既能有效地抵抗?fàn)I養(yǎng)不良，又具有降血糖、降尿酸、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、保肝等藥理作用［4-5］，是一種極具營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物。辣木于2012年被我國衛(wèi)健委批準(zhǔn)為新資源食品，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、日化、凈水等領(lǐng)域［6］。

繁育系統(tǒng)是種群有性生殖的紐帶，一般通過花表型性狀、花粉活力、柱頭可授性、花粉胚珠比等參數(shù)評判［8-9］。花粉活力的測定方法分為2種：一種為染色法，即I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、醋酸洋紅染色法等；另一種為離體萌發(fā)法，離體培養(yǎng)法是能較好地反映花粉活力真實(shí)值的方法，柱頭可授性一般采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定［10-11］。辣木原產(chǎn)于印度、肯尼亞、尼日利亞等國家，主要分布于我國的云南、海南、廣東、福建等地［7］。我國栽培的辣木多從國外引進(jìn)，國內(nèi)辣木育種進(jìn)展緩慢，優(yōu)質(zhì)品種匱乏，繁育類型分析對辣木遺傳育種工作的開展具有重要意義。本研究通過對辣木花形態(tài)特征的觀測以及花粉活力、柱頭可授性的分析，以期為辣木雜交育種工作的開展提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所辣木創(chuàng)新基地（101.87°E，25.69°N，海拔1118.2 m），屬于季風(fēng)型干熱河谷氣候，常年平均氣溫21.9 ℃，年降水量低于700 mm。選取植株健壯，生長良好，產(chǎn)量較高的辣木材料，于早晨9:00花藥散粉時(shí)，隨機(jī)摘取不同開放狀態(tài)的辣木花朵帶回實(shí)驗(yàn)室，分離出花藥與柱頭，測定花粉活力和柱頭可授性。

1.2 花部特征的觀察和測量

分別取10朵不同開放狀態(tài)的辣木花進(jìn)行解剖，并采用游標(biāo)卡尺依次測量花冠直徑、花冠長度、萼片直徑、萼片長度、雄蕊長度、雌蕊長度。

1.3 花粉活力的測定

添加300 μL的液體培養(yǎng)基于EP小管，培養(yǎng)基由175 g/L蔗糖、400 mg/L氯化鈣及150 mg/L硼酸構(gòu)成，分別取辣木不同開放狀態(tài)的花藥置于培養(yǎng)基中，每個(gè)狀態(tài)重復(fù)3次，將花粉輕輕剝離并均勻分散于培養(yǎng)液，置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，避光條件下自然培養(yǎng)，用顯微鏡（江南永新BM2000）定時(shí)觀察，花粉萌發(fā)率穩(wěn)定后，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野，每個(gè)視野不少于150粒花粉粒，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)的花粉萌發(fā)數(shù)和花粉總數(shù)，并計(jì)算花粉萌發(fā)率，根據(jù)花粉萌發(fā)率判斷花粉活力的強(qiáng)弱，計(jì)算公式如下：辣木萌發(fā)率（%）=萌發(fā)的花粉數(shù)（粒）/總花粉數(shù)（粒）×100%。

1.4 柱頭可授性的測定

取不同開放狀態(tài)的辣木花朵柱頭置于凹面載玻片上，滴加由1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的比例配制而成的反應(yīng)液至浸滿柱頭，迅速置于顯微鏡下觀察柱頭的反應(yīng)狀況，根據(jù)氣泡產(chǎn)生的多少和快慢來判斷柱頭活性的強(qiáng)弱。

1.5 異交指數(shù)（OCI）的評判

依據(jù) Dafni的標(biāo)準(zhǔn)評判辣木的繁育系統(tǒng)類型，具體如下：花朵直徑＜1 mm記為0，1～2 mm記為1，2～6 mm記為2，＞6 mm記為3；花藥開裂的同時(shí)柱頭具有可授性或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1；柱頭與花藥在同一高度記為0，空間分離記為1；三者之和為 OCI值。當(dāng)OCI=0時(shí)，交配方式為閉花受精；當(dāng)OCI=1時(shí)，為專性自交；當(dāng)OCI=2時(shí)，為兼性自交；當(dāng)OCI=3 時(shí)，自交親和，有時(shí)需要傳粉者；當(dāng)OCI=4 時(shí)，異交，部分自交親和且需要傳粉者［12］。

1.6 花粉-胚珠比（P/O）的測定

將辣木單花子房解剖，花藥溶解，并置于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)單花胚珠數(shù)及花粉數(shù)。依據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)判斷交配方式：P/O值為2.7～5.4時(shí)，閉花受精；為18.1～39.0時(shí)，專性自交；為31.9～396.0時(shí)，兼性自交；為244.7～2588.0時(shí)，兼性異交；為2108.0～195525.0時(shí)，專性異交［13］。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)辣木花粉總數(shù)和花粉萌發(fā)數(shù)，采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SAS 9.0軟件進(jìn)行方差分析，GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木花部的形態(tài)特征

辣木花形態(tài)特征性狀測定結(jié)果見表1，具體形態(tài)和開放狀態(tài)見圖1，辣木花序腋生，為圓錐花序，由上到下無明顯的開放順序（圖1A）。花有梗，氣味芳香，花瓣呈白色，底部微紅，左右對稱，花瓣5片，最上一片花瓣較大，中間兩瓣次之，最下兩瓣最小，且聯(lián)合呈龍骨狀（圖1G），花瓣直徑9.29～12.56 mm，長度為10.65～13.08 mm。萼筒盆狀，花萼5片，線狀披針形，呈白色（圖1F），直徑為8.51～13.68 mm，長度為8.18～12.01 mm，花朵開放后向下彎曲。雄蕊5枚，平均長度為7.91 mm，左右對稱分布，底部密布短絨毛，其高度從中間到兩邊依次降低，花藥黃色，退化雄蕊5枚（圖1C，圖1D）。雌蕊1枚，平均長度為7.52 mm，子房上位，子房外背短絨毛，尾部呈紅色，花柱微彎曲（圖1E）。辣木一年四季均可開花，且集中開花兩次，單次花期1周左右，花朵開放第1天花蕾萌動(dòng)，花萼先打開，第2天花瓣打開，隨著花朵開放天數(shù)的增加，花瓣顏色逐漸加深，由白色變?yōu)榈S色，并逐漸萎縮凋落；同時(shí)，柱頭逐漸高于雄蕊，若授粉成功則結(jié)為果莢（圖1H～圖1N）。

表1 辣木花表型性狀測定結(jié)果 mm

圖1 辣木單花開放進(jìn)程

2.2 花粉活力分析

采用離體萌發(fā)法對辣木花粉活力進(jìn)行評估，由圖2和圖3可知，辣木花粉粒呈類球形，有一個(gè)萌發(fā)孔萌發(fā)出花粉管，花粉管內(nèi)有內(nèi)含物分布，其長度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增長。辣木花粉在現(xiàn)蕾期有微弱的花粉活力，隨著花朵開放時(shí)間的延長，花粉活力逐漸增強(qiáng)，在花朵開放第3天時(shí)，花粉活力最強(qiáng)，且顯著高于其余狀態(tài)；第4天后，花粉活力顯著降低，第6天花粉萌發(fā)率最低，但與第4、5天差異不顯著。

圖2 辣木花粉活力的測定

圖3 辣木花粉萌發(fā)形態(tài)

2.3 柱頭可授性分析

通過聯(lián)苯胺—過氧化氫法對不同開放狀態(tài)的辣木花柱頭進(jìn)行檢測（表2，圖4），結(jié)果表明，辣木花現(xiàn)蕾期柱頭可授性較弱，部分不產(chǎn)生氣泡，柱頭無可授性；隨著開放天數(shù)的增加，柱頭可授性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)花朵開放達(dá)到第4、5天時(shí)，產(chǎn)生的氣泡最多，冒出最迅速，反應(yīng)液變藍(lán)，柱頭可授性最強(qiáng)；花朵開放第6天時(shí)，氣泡生成減少，反應(yīng)液不變色，可授性減弱。

圖4 辣木柱頭可授性檢測

2.4 繁育系統(tǒng)評判

辣木花瓣直徑9.29～12.56 mm，花冠直徑＞6 mm，賦值為3；花藥開裂時(shí)柱頭具有可授性，賦值為0；雌雄器官在空間位置分離，賦值為1。辣木雜交指數(shù)OCI值累計(jì)分值等于4。根據(jù)Dafni的標(biāo)準(zhǔn)，初步判斷繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交則需要傳粉者。

辣木花粉和胚珠形態(tài)見圖3和圖5，辣木花粉類球形，胚珠呈水滴形；單花花粉數(shù)平均為19400粒；胚珠數(shù)平均為22.67個(gè)；花粉—胚珠比（P/O）平均為855.76；據(jù)Cruden的標(biāo)準(zhǔn)，辣木P/O值在244.7～ 2588.0之間，初步判斷辣木花屬于兼性異交類型。

圖5 辣木胚珠形態(tài)

3 結(jié)論與討論

花粉活力的高低是辣木雜交育種成功的關(guān)鍵，本試驗(yàn)采用離體萌發(fā)法以及對辣木的花粉活力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)辣木在開花第3天時(shí)花粉活力最高，與呂亞等［14］研究結(jié)果稍有不同，他們認(rèn)為狹瓣辣木花粉活力在開花第2天達(dá)到最強(qiáng)，而PKM1花粉活力在開花第1天達(dá)最強(qiáng)。這可能是由于選用的辣木材料、植株生長環(huán)境不同而導(dǎo)致花粉活力的差異，花粉采集時(shí)間及培養(yǎng)環(huán)境的不同，亦會(huì)導(dǎo)致花粉活力的差異。黃瓊等［15］研究表明薄殼山核桃花粉活力由高到低的變化規(guī)律為：散粉盛期＞散粉初期＞即將散粉期＞散粉末期。楊瀾等［16］研究表明16個(gè)小時(shí)為紅司花粉最適培養(yǎng)時(shí)間，且12～28 ℃有利于提高多肉植物紅司的花粉萌發(fā)率，20～36 ℃有利于花粉管伸長。本試驗(yàn)對辣木單一材料秋季花期早晨9:00的花粉活力進(jìn)行檢測，而辣木品種材料多，且一年四季均可開花，后續(xù)還需增加不同辣木材料種類及對不同采樣時(shí)間點(diǎn)的花粉活力進(jìn)行檢測，繼續(xù)改進(jìn)和完善辣木的花粉活力檢測方法。

本試驗(yàn)采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法對柱頭可授性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在辣木開花第1天就有可授性，第4、5天時(shí)柱頭可授性最強(qiáng)。植物可通過自身的生理生化反應(yīng)來維持柱頭可授性，Bhattacharya［17］、劉輝［18］等研究表明辣木柱頭可授性與柱頭上分布的酯酶分泌物密切相關(guān)，酯酶分泌物在辣木開花第1天不表達(dá)，從開花第3天開始大量表達(dá)。相關(guān)研究［14］發(fā)現(xiàn)狹瓣辣木和PKM1柱頭可授性均在開花第3天最強(qiáng)，該結(jié)果與本研究稍有差異，這可能是由于研究對象的不同導(dǎo)致的。不同的研究對象，植物柱頭可授性持續(xù)時(shí)間長短不同，木地膚在開花第8～12天時(shí)柱頭可授性最強(qiáng)［19］，野鳶尾柱頭可授性在開花5～6 h最強(qiáng)［20］，蘭州百合在開花當(dāng)天8:00～12:00柱頭可授性最強(qiáng)［21］。周英等［22］發(fā)現(xiàn)不同木槿品種的柱頭可授性不同，淺紫紅心等品種柱頭可授性最強(qiáng)，牡丹木槿的最弱。

目前我國培育出的辣木品種主要有3種，PKM1、PKM2及紅河一號［23］，辣木優(yōu)質(zhì)品種匱乏，繁育類型研究對促進(jìn)辣木品種培育具有重要意義。辣木花朵開放第1天柱頭就有可授性，第4天達(dá)到最強(qiáng)；花粉自開放第1天起就具有活力，5朵花藥在柱頭兩側(cè)由高到低排布，為辣木自花授粉創(chuàng)造了良好的環(huán)境條件。與此同時(shí)，辣木花粉黏連在花藥上，不易吹落授粉，花朵氣味芳香，單花可為傳粉者提供60.5%糖含量的花蜜報(bào)酬物，主要傳粉者為蜂類，使辣木接受外源花粉而進(jìn)行異花授粉［24］。結(jié)合本研究的異交指數(shù)、花粉胚珠比的判定結(jié)果，筆者認(rèn)為辣木的繁育類型為部分自交親和，兼性異交繁育類型。

本文對辣木的花粉活力和柱頭可授性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)該辣木材料的花粉活力在開花第3天最強(qiáng)，柱頭可授性在開花第4、5天達(dá)到最強(qiáng)，花粉活力最高時(shí)期與柱頭可授性最強(qiáng)時(shí)期不重疊。后續(xù)開展雜交育種工作時(shí)，可選擇在開花第3天時(shí)采取花粉保存，并于開花第4天或第5天進(jìn)行授粉，授粉完成后立即套袋，防止傳粉昆蟲對授粉結(jié)果的影響。