朱頂紅試管苗離體保存及恢復生長研究

陳敏敏，張永春，蔡友銘，蘇 靜，李 心，周 琳，楊柳燕

（上海市農業科學院 林木果樹研究所/上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403）

朱頂紅（Hippeastrumspp.）為石蒜科朱頂紅屬多年生球根花卉，原產于南美地區，花朵碩大，花姿優雅，近年來在庭院綠化、家庭園藝中被廣泛應用［1］。朱頂紅田間保存主要采用種球連續種植的方法，多年種植和無性繁殖容易導致病毒感染和積累，造成種球種性退化，因此建立朱頂紅種質資源離體保存技術體系非常迫切。通過優化朱頂紅離體離體保存期間培養基添加物的種類和濃度，減少繼代頻率，有效延長離體保存時間具有重要現實意義。

限制生長離體保存是一種確保培養物能維持存活與再生潛能的同時，通過顯著減緩植物生理代謝過程以延長保存時間、降低維護成本的保存方法［2-3］，其中添加滲透性化合物和生長抑制劑是兩種常見的保存方式［4-5］。常用的生長延緩劑和抑制劑有脫落酸（ABA）［6-7］、矮壯素（CCC）［8］、甘露醇［9］、多效唑（PP333）［8,10］等。Sharaf等［11］報道在培養基中添加一定濃度的蔗糖能調節滲透壓，使植物減少對水分和礦物質的吸收，從而延長保存時間。甘露醇也有增加離體種質存活率的作用，蘭偉等［9］研究表明，20g/L的甘露醇保存香青蘭試管苗9個月后的存活率可達40%；牛愛國等［10］研究表明10 g/L甘露醇能使櫻桃試管苗保存7.5個月的存活率達到62%；馬鈴薯培養基中添加甘露醇可顯著提高存活率［4］。脫落酸（ABA）有促進衰老、抑制植株生長等生理作用［6］，郭延平等［7］研究表明ABA能抑制獼猴桃試管苗的生長，且隨著保存時間的延長，丙二醛含量積累，超氧化物歧化酶活性下降；蔣元斌［8］研究表明，低溫暗培養條件下ABA最佳處理濃度為1.0 mg/L，試管苗存活率較高。除此之外，李洋等［12］研究表明玉簪試管苗在蔗糖50 g/L+甘露醇20 g/L+脫落酸1 mg/L+矮壯素20 mg/L的培養基中保存6個月后成活率仍為100%，保存材料的細胞膜脂氧化程度降低，延緩了衰老進程；Gabriela 等［13］研究了蔗糖和嘧啶醇對少刺梅洛仙人掌和白梅洛仙人掌離體保存的影響，結果表明75 g/L的蔗糖添加可保存360 d；Koeda等［2］研究表明‘Momotaro’生根植株接種于添加2%蔗糖的MS培養基上，在10 ℃保存時，3個月后僅有27%的不定芽需要轉接。矮壯素可顯著抑制植物細胞伸長，從而使植物變矮，如培養基中添加30 mg/L矮壯素處理能使文心蘭保存12個月的存活率達76.7%～80.0%［14］。

植物生長抑制劑通過阻礙植物頂端分生組織細胞中蛋白質和核酸的生物合成、抑制其伸長和分化，從而導致植物細胞分裂速度減慢、植株變矮。隨著離體保存時間的增加，植物會發生不同程度的生理生化改變，添加物濃度不適宜易造成植物細胞內活性氧代謝失調、自由基過度積累，從而導致膜脂過氧化［12］，因此需根據不同植物種類及品種對生長抑制劑及延緩劑進行優化篩選。目前關于朱頂紅種質資源離體保存的研究報道較少，本研究通過優化朱頂紅離體保存過程中培養基添加物的種類和濃度，觀察植株離體保存5個月及恢復培養2個月后的生長發育情況，篩選適宜朱頂紅植株離體保存的最佳技術方案，為朱頂紅屬植物種質資源的保存提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

朱頂紅無菌保存材料W17無菌苗來自上海市農業科學院朱頂紅種質資源保存中心。將試管苗在MS培養基（MS+3%蔗糖+7.0 g/L瓊脂，pH 5.8）中培養，獲得直徑約1.0 cm的朱頂紅鱗球作為本研究中的試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試管苗離體保存比較 試管苗離體保存以1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+7.0 g/L瓊脂為基本培養基，pH=5.8，分別添加 15、30、45、60、75 g/L蔗 糖，10、20、30、40、50 g/L的 甘 露 醇，10、20、30、40、50 mg/L CCC和0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L ABA，以不添加生長調節劑的培養基作為對照，每瓶接種3個種球，每處理接種5瓶，培養溫度為（15±2）℃，光照時間為10 h，光照強度2500～3000 lx。每月觀察統計試管苗枯葉數、成活率，5個月后統計離體保存朱頂紅植株的株高、葉片數、葉長、根系數、根長等生長發育指標。

1.2.2 試管苗恢復培養生長發育觀測 將保存5個月的植株切去枯葉和根，將種球轉入1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L+7.0 g/L瓊脂的培養基上進行恢復培養，培養溫度為（23±2）℃，光照時間為12 h，光照強度為2500～3000 lx。每月統計植株的死亡率，2個月后測量統計朱頂紅的株高、葉長、葉片數、根數、根長等生長發育指標。

1.3 數據分析

使用SPSS 17.0軟件采用單因素方差分析法（ANOVA）進行數據分析，差異顯著性為P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 不同培養基添加物對朱頂紅離體保存的影響

2.1.1 不同濃度蔗糖對朱頂紅離體保存的影響 由表1、表2可知，在添加不同濃度蔗糖的培養基中離體保存的朱頂紅植株均正常生長發育，隨著蔗糖濃度的增加，W17植株生長速度變慢、植株高度降低。葉片從第3個月開始枯萎，到第5個月5種濃度的朱頂紅枯葉率均在60%以上，添加75 g/L蔗糖培養基的朱頂紅枯葉率達100%。離體保存5個月后，高濃度蔗糖中的植株生長速度較其他濃度植株慢，添加75 g/L蔗糖的朱頂紅生長發育緩慢，植株矮，葉片較短，不同濃度蔗糖對朱頂紅存活率的影響不大，均為100%（表2、圖1）。

2.1.2 不同濃度甘露醇對朱頂紅離體保存的影響 由表1可知，在添加不同濃度甘露醇的培養基中，朱頂紅生長發育緩慢，只長出少量葉片，且葉片從第2個月開始出現枯萎，枯萎時間早于其他幾種添加物；到第5個月時不同濃度的朱頂紅枯葉率均達20%以上，添加10 g/L甘露醇培養基的朱頂紅枯葉率達80%。不同濃度甘露醇對朱頂紅存活率的影響不大，均為100%。離體保存5個月后，在添加甘露醇的培養基中，朱頂紅植株長葉片較少，個別植株死亡；1/2 MS培養基中添加10～50 g/L甘露醇能有效抑制朱頂紅植株生長，保存5個月后恢復培養成活率達60%以上（表2、圖1）。

表1 不同外源添加物對朱頂紅W17枯葉率及存活率的影響

2.1.3 不同濃度矮壯素對朱頂紅離體保存的影響 由表1、表2可知，在添加不同濃度矮壯素的培養基中，朱頂紅生長發育較正常，葉片從第3個月開始枯萎，到第5個月5種不同濃度的朱頂紅枯葉率達40%以上，添加20 mg/L矮壯素的培養基枯葉率達100%（表1）。除添加50 mg/L矮壯素的存活率為80%外，其他濃度的存活率均為100%（表1）。隨著矮壯素濃度的增加，離體保存5個月后，植株高度呈現下降的趨勢，但W17植株高度均大于對照（表2，圖1），而且高于其他幾種添加物的，葉片數多，葉長、根長等指標也較其他添加物的高，表明10～50 mg/L矮壯素對朱頂紅試管苗生長沒有起到明顯的抑制作用。

2.1.4 不同濃度脫落酸（ABA）對朱頂紅離體保存的影響 由表1、表2可知，在添加不同濃度ABA的培養基中，朱頂紅很少長葉片，少量長出的葉片從第3個月開始枯萎，到第5個月5種不同濃度的朱頂紅枯葉率達20%以上，添加0.5 mg/L ABA的培養基的朱頂紅枯葉率達60%。除添加1 mg/L ABA培養基的朱頂紅的存活率為80%外，添加其他濃度ABA對朱頂紅存活率的影響不大，均為100%（表1）。離體保存5個月后，在添加ABA的培養基中，朱頂紅植株高度均低于對照，添加1～4 mg/L ABA的朱頂紅不長根（表2，圖1）。ABA的添加明顯抑制了朱頂紅植株的生長發育，且恢復生長后植株死亡率較其他幾種添加物高，0.5～4.0 mg/L ABA離體保存5個月后恢復生長培養2個月的死亡率為20%～50%。

圖1 不同外源添加物對朱頂紅W17離體保存的影響

表2 朱頂紅W17離體保存5個月的形態指標

2.2 不同培養基添加物對朱頂紅恢復生長的影響

2.2.1 不同濃度蔗糖處理對朱頂紅恢復生長的影響 恢復生長培養60 d后統計朱頂紅死亡率，發現不同蔗糖濃度培養條件下的朱頂紅植株死亡率為0，表明添加蔗糖濃度10～75 g/L不會造成朱頂紅種球死亡（表3），植株生長發育正常。其中在60 g/L蔗糖中離體保存的朱頂紅恢復培養時植株高度最高，為14.60 cm；葉長最長，為12.74 cm；葉片數在添加45 g/L蔗糖培養基中最多，為12.20（表4）。添加75 g/L蔗糖作為離體保存朱頂紅的外源添加物效果較好。

表3 不同外源添加物對朱頂紅W17離體保存后恢復生長的影響

2.2.2 不同濃度甘露醇處理對朱頂紅恢復生長的影響 恢復生長培養60 d后統計朱頂紅死亡率，發現添加50 g/L甘露醇離體保存條件下恢復生長時有40%的植株死亡，添加10～40 g/L甘露醇離體保存條件下恢復生長時死亡率為0%（表3），表明太高濃度的甘露醇不適合用于朱頂紅離體保存。添加30 g/L甘露醇離體保存條件下恢復生長時植株高度為5.36 cm，添加40 g/L甘露醇離體保存條件的葉片數最多，為14.60（表4），甘露醇較適宜的添加濃度為20～40 g/L。

2.2.3 不同濃度矮壯素處理對朱頂紅恢復生長的影響 恢復生長培養60 d后統計朱頂紅死亡率，發現不同矮壯素濃度培養條件下的朱頂紅植株死亡率為0，表明矮壯素添加濃度10～50 mg/L不會造成朱頂紅種球死亡（表3），植株生長發育正常。不同矮壯素濃度離體保存后恢復生長植株高度變化不大，其中在添加50 mg/L矮壯素離體保存的朱頂紅恢復培養時植株高度最高，為8.80 cm；在添加30 mg/L矮壯素離體保存的朱頂紅恢復培養時葉片數最多，為10.80（表4）。

2.2.4 不同濃度脫落酸（ABA）處理對朱頂紅恢復生長的影響 恢復生長培養60 d后統計朱頂紅死亡率，發現不同ABA濃度離體保存條件下的朱頂紅植株死亡率較高，恢復生長1個月后統計添加不同ABA濃度離體保存下，恢復生長時植株死亡率從20%到25%不等，恢復生長2個月后統計添加不同ABA濃度離體保存下，恢復生長時植株死亡率從20%到50%不等（表3）。添加的ABA濃度越高，恢復生長培養時植株高度越低（表4）。添加ABA作為離體保存朱頂紅的外源添加物恢復生長后死亡率較其他幾種外源添加物高。

表4 朱頂紅W17恢復生長2個月的形態指標

3 討論

蔗糖、脫落酸、甘露醇及矮壯素等外源添加物用于離體保存在不同植物中均有成功的報道，本研究分析了培養基中單獨添加這4種外源添加物對朱頂紅種球離體保存的影響，發現離體保存的效果差異較顯著。

蔗糖對植物離體培養有雙重作用，合適濃度的蔗糖可以為植株生長發育提供碳源，而高濃度的蔗糖則會形成滲透脅迫，從而抑制植物生長發育，有利于植物的離體保存研究［15-16］。如Siberia百合在添加50～90 g/L蔗糖的培養基中能保存試管苗11個月以上［17］。MS培養基中添加90～110 g/L的蔗糖能抑制大花卷丹的生長［18］，但蔗糖濃度過高也會對植株產生毒害作用，如王小樂等［19］在菊花中的研究表明，在60 g/L蔗糖處理下，南農橙乒乓和小洋菊保存12個月存活率達70%以上，但植株生長狀況差，40～90 g/L蔗糖對蒙娜麗莎黃和橙安娜保存效果不佳，相似的結果也在木薯［20］等植物中報道過，因此，需根據離體保存的材料和品種進行篩選優化。本研究發現朱頂紅W17在75 g/L蔗糖離體保存5個月能顯著抑制朱頂紅植物的生長發育，且恢復生長培養狀態良好，這與同為球根植物的百合的研究結果較相近，蔗糖適宜濃度均高于菊花等草本類花卉。

ABA作為生長抑制劑具有促進植物休眠的作用。在培養基中添加1.0～3.0 mg/L的脫落酸能有效延長Siberia百合試管苗的繼代培養間隔時間，離體保存9個月時存活率均超過80%［17］。0.2～2.0 mg/L的ABA保存木薯的長勢和存活率均較差［21］。本研究中ABA與矮壯素、甘露醇和蔗糖相比，隨著培養基中ABA濃度的增加，植株死亡率升高，說明0.5～4.0 mg/L ABA不太適用于朱頂紅離體保存。

作為滲透調節物質，甘露醇添加會造成植物養分和水分吸收較困難，導致新陳代謝減弱［22］。王小樂等［19］研究表明，15 g/L的甘露醇使南農橙乒乓和小洋菊試管苗的離體保存達12個月，20 g/L甘露醇能使蒙娜麗莎黃和橙安娜的保存達12個月。陳輝等［17］報道培養基中添加10～50 g/L甘露醇對Siberia百合試管苗生長沒有起到明顯的限制作用。本研究使用30 g/L甘露醇可使朱頂紅W17保存5個月的存活率達100%；當甘露醇濃度達50 g/L時，保存5個月后朱頂紅植株存活率降低為60%。朱頂紅離體保存中甘露醇濃度均高于菊花、櫻桃、香青蘭等植物，說明不同種植物對甘露醇滲透脅迫的適應性存在較大的差異，這可能與朱頂紅是地下鱗莖類球根花卉，對甘露醇的耐受能力較強有關。

紀伊潮菊在1500～2000 mg/L的矮壯素中保存試管苗12個月存活率達92.86%～96.43%［23］。培養基中添加200 mg/L矮壯素對寶石無核、前項無核和黑比諾3個品種試管苗的生長抑制效果明顯［24］。添加10～40 mg/L矮壯素對Siberia試管苗生長沒有起到明顯的抑制作用［17］。本研究添加10～50 mg/L矮壯素對朱頂紅植株離體保存期間的矮化效果并不明顯，經矮壯素處理5個月后的植株均能正常生長發育，這與前人在Siberia試管苗中報道的結果一致，今后需提高矮壯素濃度進一步篩選優化。李洋等［12］報道，玉簪試管苗在蔗糖50 g/L+甘露醇20 g/L+脫落酸1 mg/L+矮壯素20 mg/L中保存6個月存活率仍為100%，通過了解單獨添加的生長抑制及恢復培養后的效果，今后也可進一步優化幾種生長抑制劑共同添加對朱頂紅離體保存及恢復培養的影響，為朱頂紅種質資源離體保存提供理論依據與技術支撐。