苯丙氨酸解氨酶基因響應(yīng)小麥逆境脅迫的研究進(jìn)展

譚一羅，張廣旭，王康君，郭明明，孫中偉，李曉峰，樊繼偉

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

小麥（Tritium aestivumL.）作為世界主要糧食作物之一，小麥的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)在保障糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位［1］。為了應(yīng)對各種逆境環(huán)境，植物在生長過程中進(jìn)化出多種脅迫響應(yīng)和免疫應(yīng)答機(jī)制。研究表明，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）基因家族參與了植株對各種逆境脅迫的適應(yīng)和抵抗，在植物生長發(fā)育和環(huán)境互作中起重要作用，常被用作衡量植物抗逆性的指標(biāo)之一。PAL基因?qū)儆诹呀饷割惓易寤颍鳛楸奖轭惔x的第1個酶，產(chǎn)生各種次級代謝物的前體，編碼多種保護(hù)性化合物，廣泛存在于高等植物和微生物中。苯丙烷類代謝是植物苯丙烷類骨架物質(zhì)產(chǎn)生的一條重要次生代謝途徑，其直接或間接產(chǎn)生具有植物生長發(fā)育、植物抗逆反應(yīng)、活性氧清除和抗毒素等多種與生物功能相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物，如與細(xì)胞壁形成相關(guān)物質(zhì)、酚類和黃酮類化合物、生物堿等［2-3］。對小麥PAL基因及其編碼蛋白質(zhì)和功能進(jìn)行研究，有助于闡明其在小麥生長發(fā)育和免疫防御中的作用，為小麥逆境脅迫中的反應(yīng)機(jī)制和抗性育種研究提供新思路。本文對小麥PAL基因序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)特性，以及其在小麥脅迫響應(yīng)中的分子機(jī)制和功能進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。

1 小麥PAL基因的序列特征

植物PAL基因通常編碼包含700個氨基酸左右的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)編碼區(qū)長度在2100 bp左右，大部分gDNA包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，不同植物間內(nèi)含子長度變化較大［4］。植物PAL基因家族是一個龐大的多基因家族，研究報道玉米中有10個PAL，擬南芥和煙草中有4個PAL，西紅柿和馬鈴薯中有超過20個PAL［5～8］。Rasool等［9］研究了小麥PAL基因的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和順式調(diào)控元件，研究表明普通小麥中有37個PAL家族基因，覆蓋11條染色體，呈不均勻分布。小麥PAL基因數(shù)量顯著高于其他物種，推測是因小麥全基因組重復(fù)、小規(guī)模節(jié)段重復(fù)、串聯(lián)重復(fù)等事件發(fā)生導(dǎo)致的。虞光輝等［10］從小麥品種蘇麥3號中克隆了4個PAL基因，其開放閱讀框（ORF，open reading frame）長度在2016～2142 bp，編碼672～714個氨基酸，4個PAL基因序列相似性為88.35%，分別位于小麥6B、2D和2B染色體上，其中TaPAL2和TaPAL4均位于2D染色體。李秋娥等［11］研究表明單子葉植物PAL基因密碼子受到突變與自然選擇雙重影響，偏好以G/C編碼。

2 PAL蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)特性

雖然植物PAL蛋白在不同物種間數(shù)量差異較大，但保守性極高，其酶活性位點主要存在于PAL-HAL結(jié)構(gòu)域上，且大都含有GTITASGDLVPL SYIAG酶活性中心序列［12-13］。第1種植物PAL是在歐芹（Petroselinum crispum）中以晶體形式發(fā)現(xiàn)。小麥編碼的PAL蛋白同屬于PAL基因家族，通常包含498～714個氨基酸，分子量在52.78～77.34 kDa，平均分子量為74.97 kDa，等電點為5.76～7.57，大多呈酸性。Rasool等［9］研究發(fā)現(xiàn)37個小麥PAL基因編碼的蛋白質(zhì)均包含HAL-PAL結(jié)構(gòu)域。研究表明小麥品種蘇麥3號編碼的4個PAL氨基酸相似性高達(dá)91.92%，均為弱酸性的親水蛋白［10］。同源模建（圖1）顯示小麥PAL與歐芹PAL相似性為74.29%，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-折疊等結(jié)構(gòu)。植物PAL的分布與細(xì)胞分化程度有關(guān)，其表達(dá)具有組織器官特異性，PAL基因大多在植物成熟的花和根部表達(dá)量較高，其次為莖部，在成熟植物葉片中較難檢測到其表達(dá)。

3 PAL響應(yīng)植物逆境的分子機(jī)制

PAL作為苯丙烷類代謝的限速酶，一方面將L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）作為底物，催化氨和反式肉桂酸（trans-Cinnamate）的合成［14］（圖1A），為下游木質(zhì)素等次級代謝產(chǎn)物合成提供底物；另一方面，PAL能直接以L-酪氨酸（L-Tyrosine）為底物生成4-香豆酸（4-Coumarate）（圖1B），通過苯丙烷類途徑間接影響植保素合成。木質(zhì)素是一種復(fù)雜的外消旋芳香族多聚合物，由羥基肉桂醇單體甲氧基化而來，為植物提供機(jī)械支撐、運(yùn)輸水和養(yǎng)分，通過加強(qiáng)木質(zhì)素在植物次生細(xì)胞壁中的沉積來增厚細(xì)胞壁，從而在植物逆境中形成物理屏障，進(jìn)而提高植物抗性［15-16］。黃酮類化合物是一類以2-苯基色酮為基礎(chǔ)的酚類化合物，可以通過抑制病原體分泌的植物細(xì)胞壁降解酶活性來保護(hù)植物細(xì)胞壁的完整性。Kim等［17］發(fā)現(xiàn)擬南芥MYB15通過激活PAL等木質(zhì)素合成相關(guān)基因抵御病原體感染，且木質(zhì)素單體松柏醇的外源供應(yīng)能恢復(fù)MYB15缺陷植株對病原體的免疫。植物能夠通過調(diào)節(jié)PAL基因表達(dá)來調(diào)控苯丙烷類途徑中次級代謝產(chǎn)物的含量，如異黃酮、類黃酮、酚酸等，從而影響植株對干旱、營養(yǎng)缺失、鹽脅迫、重金屬等非生物脅迫和生物脅迫的響應(yīng)［18-25］。Wu等［26］根據(jù)PAL在小麥赤霉病侵染中的早期表達(dá)推測其可能在赤霉病TypeⅠ抗侵染（resistance to initial infection）中起作用，但主要功能是激活在Type Ⅱ抗擴(kuò)展（resistance to fungal spread within the infected spikes）中發(fā)揮作用的苯丙烷類途徑。此外，PAL還能通過影響水楊酸（salicylic acid，SA）和下游次級代謝物的合成來應(yīng)對逆境。Shine等［27］發(fā)現(xiàn)黃豆中PAL與異分支酸合成酶共同參與SA的合成，進(jìn)而影響植物免疫應(yīng)答。

圖1 PAL蛋白質(zhì)同源模建

4 PAL在小麥逆境脅迫中的功能

4.1 PAL響應(yīng)小麥非生物脅迫

近年來研究表明，PAL基因在植物生長中發(fā)揮重要作用，且在非生物脅迫下受到誘導(dǎo)表達(dá)，如重金屬脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫等。Wei等［28］研究了普通小麥的D基因組供體山羊草（Aegilops tauschii），發(fā)現(xiàn)AetSRG1的蛋白質(zhì)與PAL相互作用，且AetSRG1可以穩(wěn)定PAL并促進(jìn)內(nèi)源性SA的合成，進(jìn)而響應(yīng)鎘脅迫。PAL作為小麥鹽脅迫耐受性的評價指標(biāo)，研究表明鹽脅迫條件下小麥根系Na+含量增加，PAL活性增強(qiáng)，且相較于耐鹽基因型小麥品種，鹽脅迫對鹽敏感基因型小麥的影響更顯著［29-30］。Wang等［31］研究表明低溫脅迫使PAL和內(nèi)源性SA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，PAL（作為參與SA生物合成的關(guān)鍵酶）和SA在小麥抗凍反應(yīng)中可能涉及抗氧化能力和冷響應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)。Kolupaev等［32］發(fā)現(xiàn)H2S處理下小麥通過PAL活性的調(diào)控影響植株類黃酮化合物積累，從而提高小麥幼苗對低溫脅迫的抗性。Li等［33］研究表明干旱脅迫下灌漿期小麥的旗葉和穗部PAL等苯丙烷類途徑相關(guān)酶活性呈先增后減的趨勢，說明干旱脅迫促進(jìn)了這些酶活性的升高。Koramutla等［34］發(fā)現(xiàn)小麥在水淹脅迫下通過PAL和異分支酸合酶基因表達(dá)來提高莖節(jié)中SA含量，進(jìn)而在乙烯作用下誘導(dǎo)通氣組織形成。

圖2 PAL催化反應(yīng)

4.2 PAL參與小麥抗蟲防御反應(yīng)

Leon 等［35］使用VIGS靶向沉默具有蚜蟲抗性的俄羅斯小麥的WRKY53 和PAL基因表達(dá)，沉默后其基因轉(zhuǎn)錄本豐度均降低到與易感小麥相似水平，植株在蚜蟲侵染時都表現(xiàn)出易感表型，且WKRY53 的沉默也抑制了PAL表達(dá)，推測這些基因在相同的防御反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Zhang 等［36］研究發(fā)現(xiàn)易變山羊草中AevPAL1基因能通過影響水楊酸（sodium salicylate，SA）和下游次級代謝物的合成，進(jìn)而調(diào)控植株對禾谷孢囊線蟲（cereal cyst nematode，CCN）的抗性，且在易變山羊草中沉默AevPAL1后CCN感染發(fā)生率明顯提高，而過表達(dá)AevPAL1能夠顯著增強(qiáng)小麥的CCN抗性，并且對小麥生長及產(chǎn)量等性狀無明顯影響。

4.3 PAL參與小麥抗病防御反應(yīng)

隨著多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來研究表明小麥PAL基因的表達(dá)與小麥赤霉病等病害應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān)，推測該基因參與了小麥對病原菌的防御過程。Kosova等［37］研究發(fā)現(xiàn)蘇麥3號接種鐮刀菌和DON毒素會顯著增加應(yīng)激保護(hù)蛋白的合成，PAL、BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶等顯著積累，這可能是蘇麥3號品種抗性優(yōu)越的基礎(chǔ)。Li等［38］從轉(zhuǎn)錄水平證實了小麥PAL基因在稈銹菌誘導(dǎo)的抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Sorahinobar等［39］研究表明SA能提高小麥對赤霉病的防御能力，提前施用SA能夠促進(jìn)PAL、CYP450等基因的表達(dá)，推測這些基因與小麥赤霉病防御存在關(guān)聯(lián)。Duba等［40］研究表明，小麥高表皮毛狀體密度在抵抗鐮刀菌侵染方面起關(guān)鍵作用，且接種鐮刀菌后抗性品種的PAL活性和ROS含量顯著高于易感小麥。Kage等［41］利用小麥的兩個不同赤霉病抗性的近等基因系（易感NIL-S和抗性NIL-R），對其接種禾谷鐮刀菌后進(jìn)行代謝組研究，并基于QTL-2DL位點將GPAT、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、CER5和PAL基因作為候選基因，且這些候選基因在NIL-R中的轉(zhuǎn)錄水平較NIL-S顯著上調(diào)，說明它們可能參與了抗性相關(guān)代謝物的生物合成。此外，該研究發(fā)現(xiàn)小麥小穗對赤霉病的抗性主要是通過角質(zhì)和木栓質(zhì)分子沉積，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁來抵抗病原菌侵染。

5 小結(jié)

隨著生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，通過正向遺傳學(xué)或多組學(xué)分析手段闡明小麥逆境響應(yīng)機(jī)制，挖掘相關(guān)抗性基因成為可能，小麥參與植物抗逆反應(yīng)的各種生物學(xué)過程不斷被發(fā)現(xiàn)。挖掘小麥逆境脅迫下的調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)，完善小麥逆境響應(yīng)的分子機(jī)制，對小麥抗逆品種遺傳改良有重要理論價值和應(yīng)用前景。