添加外源酚酸條件下有機肥對辣椒化感效應的調控研究

張衛東，劉 宇，吳云成，劉明慶，趙家印，王蒙蒙，陳 哲，田 偉*

（1.生態環境部南京環境科學研究所，江蘇 南京 210042；2.河海大學 農業工程學院，江蘇 南京 210098）

0 引言

伴隨著現代農業的發展，連作障礙已經成為農業生產中的世界性難題。連作障礙是指在同一地塊連續多茬種植同種或同科作物后，植株長勢變弱、病蟲害加重、產量和品質下降的現象［1］，化感物質的逐年積累以及由此引起的土壤根際微生物群落結構的失衡是連作障礙發生的重要誘因。研究表明，酚酸類化感物質是影響植物幼苗生長的重要因素［2］。酚酸類物質是單一連作體系中重要的化感物質，可通過直接的自毒作用或間接的抑制作用，使土壤向“利病型土壤”轉化［3］。因此，要防治與克服連作障礙，必須從土壤微生物區系著手，構建一個健康的土壤微生物區系，并設法維持。大量研究結果表明，生物防治是治理土傳病害最有效、最安全的途徑［4-6］。

有機肥的生產過程是一個由不同種類的微生物參與的自發的生物學過程［7］，研究表明，腐熟的有機肥存在大量的細菌、真菌和放線菌等微生物，施用有機肥不但具有培肥土壤、增加作物產量、改善作物品質等作用，同時能夠調控土壤微生物區系特征［8-9］。本試驗以辣椒根系分泌物以及殘留物中的酚酸類物質：香草酸（VA）、水楊酸（SA）與苯甲酸（BA）等為代表，重點關注了在此類化感物質存在的情況下，有機肥對辣椒種子的發芽情況和幼苗生長的影響以及對土壤微生物功能的調控作用，以期為研究連作障礙中根際調控技術提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采自江蘇省儀征市江揚農業生態有限公司四莊基地，該土壤的pH值為 7.20，有機碳含量為19.21 g/kg，總氮含量為1.87 g/kg,有效磷含量為172.31 mg/kg，有效鉀含量為31.56 mg/kg。

1.2 實驗設計

將辣椒種子的表面用5%的過氧化氫（H2O2）消毒30 min，再用無菌水清洗3次，然后放在含有濕式過濾紙的培養皿中，保持30 ℃發芽48 h，最后將種子移入盆中。實驗包括7個處理：（1）CK（未添加酚酸的土壤）；（2）BA（添加苯甲酸）；（3）BA+OF（添加苯甲酸和有機肥）；（4）SA（添加水楊酸）；（5）SA+OF（添加水楊酸和有機肥）；（6）VA（添加香草酸）；（7）VA+OF（添加香草酸和有機肥）。每個處理重復3次。在播種7 d后采集土壤，并將其保存在4 ℃下冷藏待后期分析。各酚酸處理過程為：將每種酚酸在乙醇中溶解后分別加入到土壤中，使其濃度最終達到5 mg/g。各有機肥處理過程為：在添加有機肥的處理中按1.0%的比例添加牛糞有機肥，有機肥的基本理化性質為：全氮1.34%、全磷1.58%、全鉀0.92%。

1.3 測定指標與方法

土壤常規理化指標分析［10］：土壤pH值采用土∶水=1∶10浸提，用pH計測定；銨態氮含量采用氯化鉀浸提─靛酚藍比色法測定；硝態氮含量采用紫外分光光度法測定；速效鉀含量采用乙酸銨浸提─火焰光度法測定；有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提─鉬銻抗比色法測定；土壤酚酸類化合物采用液相色譜法（HPLC）測定［11］。

土壤微生物數量：以鮮土樣為測定對象，采用試管梯度稀釋涂平板法測定土壤細菌、真菌和放線菌數量，采用的培養基分別是牛肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏培養基和高氏培養基［12］。微生物功能多樣性采用Biolog-Eco微平板測定，微平板含96孔、共31種碳源，放置于25 ℃恒溫恒濕培養箱培養8 d，每12 h用酶標儀讀取各孔在590 nm波長下的數值［13］。

1.4 統計分析

采用孔平均顏色變化率法測定微生物利用單一碳源的能力。

平均顏色變化率（AWCD）=∑(Ci-R+)/31

其中，Ci為各反應孔在590 nm 的光密度值；R為ECO 板對照孔A1 的光密度值；Ci-R小于零的孔在計算中記為零。采用PCA（Canoco 4.5）軟件對接種84 h 后的31 種碳源的OD 值進行主成分分析［14-15］，測定數據經Microsoft Excel 2010軟件整理后，用SPSS 18.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 外源酚酸和有機肥對土壤理化性質的影響

由表1可知，與CK相比，酚酸處理（BA、SA、VA）以及酚酸-有機肥處理（BA+OF、SA+OF、VA+OF）均明顯改變了土壤的基礎理化性狀，土壤的pH值、銨態氮和硝態氮含量都有提升，其中銨態氮的含量顯著增加；酚酸-有機肥處理（BA+OF、SA+OF、VA+OF）中的有效磷、速效鉀含量顯著增加。與對應的酚酸處理（BA、SA、VA）相比，酚酸-有機肥處理（BA+OF、SA+OF、VA+OF）顯著增加了土壤速效鉀的含量，降低了土壤的pH值。對于土壤pH值的變化，各處理之間并未表現出一致的規律性。

表1 外源酚酸和有機肥對土壤理化性質的影響

2.2 外源酚酸和有機肥對辣椒種子的發芽率以及土壤中酚酸濃度的影響

與CK相比，酚酸處理均顯著抑制了辣椒種子的發芽（圖1a），BA、SA與VA處理的種子發芽率明顯降低，分別降低至47.6%、14.8%、38.2%。而酚酸-有機肥處理則對酚酸抑制辣椒種子發芽具有緩解效應，BA+OF、SA+OF和VA+OF處理的辣椒種子發芽率分別達到了63.2%、51.5%和71.8%。

不同處理間土壤中總酚酸含量表現不同（圖1b）。SA+OF 處理的總酚酸含量最高，達613.7 mg/kg；CK 的總酚酸含量最低，為91.9 mg/kg。BA 處理的總酚酸含量（330.5 mg/kg）高于BA+OF 處理的總酚酸含量（236.2 mg/kg）。VA 處理的總酚酸含量（239.7 mg/kg）高于VA+OF 處理的總酚酸含量（239.7 mg/kg），而SA 處理的總酚酸含量（173.8 mg/kg）顯著低于SA+OF 處理的總酚酸含量（613.3 mg/kg）。

2.3 外源酚酸和有機肥對土壤可培養微生物數量的影響

與CK相比，酚酸與酚酸-有機肥處理均明顯抑制了土壤細菌的數量（圖2a），分別降低至1.7×107～1.6×108、6.1×107～2.6×108cfu/g。但相較于對應的酚酸處理，酚酸-有機肥處理中的BA+OF和SA+OF中土壤細菌的數量分別為1.4×108和2.6×108cfu/g，顯著高于BA和SA的單獨酚酸處理的1.7×107、1.7×108cfu/g。相較于SA處理，SA+OF處理土壤真菌的數量顯著降低（圖2b）。BA+OF和VA+OF處理中的放線菌的數量顯著高于對應的BA和VA處理（圖2c）。

2.4 外源酚酸和有機肥對土壤微生物功能多樣性的影響

土壤微生物群落對碳源的利用能力可以通過平均顏色變化率（AWCD）來反映，其能夠直觀反映微生物的生長情況。由圖3可知，較未添加酚酸的CK處理，酚酸的添加，尤其是苯甲酸的添加，顯著抑制了土壤微生物對碳源的利用。與單獨添加酚酸的處理相比，添加有機肥在一定程度上增加了平均顏色變化率，BA+OF處理和VA+OF處理的平均顏色變化率分別為1.3和1.4，顯著高于BA處理和VA處理的0.9和1.1。

由圖4可看出，與BA處理相比，BA+OF處理消耗較多的碳水化合物類、羥酸類、氨基酸類、胺類、酚類化合物，并消耗較少的聚合物。與SA處理相比，SA+OF處理消耗較多的碳水化合物類、氨基酸類與胺類，并消耗較少的聚合物。與VA處理相比，VA+OF處理消耗較多的聚合物、碳水化合物類、羥酸類、氨基酸類、胺類、酚類化合物以及聚合物。

圖4 不同處理中各碳源的平均顏色變化率

2.5 外源酚酸和有機肥對微生物碳源利用特征的影響

為確定不同處理的土壤微生物對碳源利用能力的差異化程度，對所有處理的平均顏色變化率進行了PCA分析。由圖5可以看出，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別解釋了所對應變量方差的70.8%和 21.0%，2個主成分累計達到了91.8%，作為變異的主要來源，可以用來表征不同處理間微生物碳源利用的差異。酚酸+有機肥處理與酚酸處理分布于不同的象限，表明各處理利用碳源的差異比較明顯。

圖5 不同處理的碳源利用能力的主成分分析

3 討論

在雙碳戰略背景下，可持續農業是世界農業發展的必然，通過發掘土壤本身的生產潛力，降低化肥、農藥等化石能源的投入，構建循環農業體系，減少土傳病害的發生［16］。我國是農業廢棄物生產大國，堆肥是一種經濟、環保的農業固體廢棄物資源化的利用方式［17］。本文重點關注了在化感物質存在的情況下，有機肥對辣椒種子的發芽情況和幼苗生長的影響以及其對土壤微生物功能的調控作用。

本實驗結果表明，外源酚酸的添加具有一定的活化土壤營養成分的作用，土壤中氨態氮、硝態氮、有效磷和速效鉀的含量較對照來說總體得到了提升，這可能是由于外源酚酸的添加，選擇性地促進了某一類或者某幾類以此酚酸為碳源和能源的土壤微生物的生長，提高了土壤中難利用養分的礦化效率。相反，改變土壤有效態養分（硝態氮、有效磷、速效鉀）的含量也可能會改變土壤微生物群落結構［18］。有機肥能夠增加土壤有機質含量并且為作物生長提供養分，本實驗有機肥添加處理顯著增加了土壤中有效磷和速效鉀的含量，這與前期的研究結論一致［19］。

外源酚酸的添加對辣椒幼苗的生長具有明顯的抑制作用，Asao等［20］報道，在芋頭根系分泌物中含有大量的酚酸類物質，包括苯甲酸、香草酸和琥珀酸等，其中苯甲酸對芋頭幼苗具有明顯的抑制作用。研究表明，在未滅菌的土壤中，即使土壤中酚酸的濃度很高，也能被土壤中的微生物快速降解［21］。因此，土壤中微生物的數量、結構和活性決定了酚酸在土壤中的停留時間，同時決定了種子的發芽率，但是要注意的是，施用有機物料來控制土傳病原菌與具體的有機物料和土傳病原菌的種類有關［22］。例如，SA+OF處理中水楊酸的含量高于SA處理，初步認為在有機物料的微生物降解過程中，有一定數量的水楊酸釋放到了土壤中［23］。

有機肥施用是一種有效的土傳病害的防控措施，在有機質的降解過程中，土壤中 k 型和 r 型微生物的比值隨著微生物區系的演替而改變［3］，而這種比值往往與土壤的抑病能力有關。本研究發現，外源酚酸的添加一定程度上抑制了細菌的生長，而有機肥能夠緩解這種抑制效應，促進可培養細菌和放線菌的生長繁殖，尤其是苯甲酸+有機肥處理，這種促進效應更加明顯。研究表明，土壤細菌數量/真菌數量的比值越高，越有利于降低土壤病害的發生概率［24］，這可能是細菌和放線菌的快速繁殖在一定程度上抑制了有害真菌的生存。另外，土壤中的放線菌一般能夠產生抗生素等一些次生代謝產物，從而抑制了病原微生物的生長。但是，由于酚酸種類的差異及其對微生物的選擇性，因此，并不是所有的酚酸+有機肥處理的微生物數量會表現出一致的規律性。

平均顏色變化率值反映了土壤微生物利用碳源的能力和代謝活性的大小，其值越高，土壤中微生物群落代謝活性也就越高［25］。本文通過研究外源酚酸及酚酸+有機肥條件下土壤微生物碳源利用能力，分析了有機肥的添加對土壤微生物功能多樣性的影響。研究結果表明，與單獨添加酚酸處理相比，添加有機肥可顯著改變土壤細菌群落的碳代謝能力，有機肥處理的細菌種群增加了對碳水化合物、羥酸、氨基酸、胺類以及酚類化合物的利用。寧趙等［26］研究發現，施用有機肥可顯著增加土壤微生物的碳源利用能力，提高微生物對碳水化合物的代謝速率。張玥琦等［27］研究了不同施肥措施對番茄連作土壤微生物功能多樣性的影響，發現雞糞和稻草等有機物料的投入均能在一定程度上提高土壤微生物碳源利用能力。Poulsen等［28］從生態學的角度研究了植物根際微生物多樣性與土傳病害發生的關系，表明根際細菌種群及功能多樣性越豐富，其抑制病原菌生長的能力就越強?？傮w來說，在添加外源酚酸條件下，有機肥對辣椒化感效應具有正向調控作用。

4 結論

有機肥施用提高了土壤中可利用養分的含量和辣椒種子的發芽率，降低了酚酸的含量，提高了土壤細菌和放線菌的數量和微生物群落對碳源的利用能力，是一種有效預防和控制土壤連作障礙的措施。