一株共青土壤產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌的分離純化與鑒定

江 強(qiáng)，占?jí)翩茫?鵬，程夢(mèng)琴，余 超，郭建業(yè)，陳柳萌，李 敏*

（1.南昌大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院 理工學(xué)科部 生物化學(xué)系，江西 九江 332020；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌 330200）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性嗜熱細(xì)菌，廣泛分布于土壤中，與植物微生態(tài)聯(lián)系密切，可分泌活性較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，其中堿性蛋白酶水解蛋白的能力更強(qiáng)［1-2］。在惡劣環(huán)境條件下，能夠產(chǎn)生孢子抵御不良條件的影響，對(duì)不同環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，且易于保存。地衣芽孢桿菌具有非常大的工業(yè)應(yīng)用潛力，目前已成為重要的工業(yè)生產(chǎn)菌種。其活性菌被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收，從而利于其生長(zhǎng)。同時(shí)還被用于制備成生物制劑，通過(guò)其生物奪氧機(jī)制抑制致病菌的生長(zhǎng)并且可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，以膠囊等形式治療動(dòng)物及人體腸道菌群失調(diào)，提高人體免疫力［1，3，4］。另外，地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抗生素［2］，且對(duì)動(dòng)植物無(wú)毒無(wú)害、不殘留且對(duì)病原菌不易產(chǎn)生耐藥性［1，5］，具有制備不耐藥型抗生素的潛力。地衣芽孢桿菌還被證實(shí)對(duì)養(yǎng)殖的水質(zhì)具有凈化作用［6］。

堿性蛋白酶（Alkaline protease）是一類(lèi)可在堿性環(huán)境下將蛋白質(zhì)水解成多肽和氨基酸的蛋白酶，最適反應(yīng)的pH值范圍在9～11之間［7］。堿性蛋白酶是一種非常重要的工業(yè)酶，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、皮革和洗滌劑的工業(yè)生產(chǎn)中［8］。與植物和動(dòng)物相比，微生物是一種有吸引力的蛋白酶來(lái)源，可通過(guò)現(xiàn)有的發(fā)酵方法在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)大量培養(yǎng)并產(chǎn)生大量穩(wěn)定的生物活性產(chǎn)品。此外，微生物的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，可在低于理想環(huán)境下儲(chǔ)存數(shù)周，貨架期更長(zhǎng)［9］。堿性蛋白酶主要來(lái)源于地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和小芽孢桿菌等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)產(chǎn)堿性蛋白酶的芽孢桿菌進(jìn)行了篩選和發(fā)酵條件的研究。舒丹等［10］從西藏尼木卡如林溫泉土壤中分離得到一產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢桿菌，具有良好的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，并顯示出與去污劑有良好的相容性。黃繼翔［11］從土壤中篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶菌株Bacillus sp.HFBL0079，該菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶可水解多種天然蛋白質(zhì)，并對(duì)膠原蛋白和羽毛蛋白有較高的水解度。

目前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶已經(jīng)成為工業(yè)發(fā)酵的熱點(diǎn)。隨著微生物在工業(yè)發(fā)酵中的作用越來(lái)越大，吸引了許多國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶工藝的研究，但一般從自然界中篩選出來(lái)的野生菌株產(chǎn)酶能力較弱，遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，有大量的研究者通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行誘變或改變菌株的發(fā)酵條件從而達(dá)到增加產(chǎn)酶量的效果。候澤林［12］從腐植質(zhì)較多的土壤中篩選出一株酶活為260.7 U/mL的解淀粉芽孢桿菌T-18，誘變后的酶活達(dá)到了2337 U/mL，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活高達(dá)1229 U/mL。徐子淵等［13］誘變?cè)a(chǎn)堿性蛋白酶菌株2709，所獲得變異株C1213酶產(chǎn)量較之原菌株提高了40%。周桂旭［14］利用定點(diǎn)突變的技術(shù)分別對(duì)堿性蛋白酶基因的188位、239位、262位氨基酸殘基進(jìn)行基因定點(diǎn)突變，構(gòu)建了4個(gè)突變體，其酶活力相對(duì)野生型均有不同程度的提高，其中最高較原菌株提高了3.3倍。同時(shí)，突變后的菌株在催化效果和熱穩(wěn)定性上也有明顯的提升。另外，周魏等［15］通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組分比例、pH值、培養(yǎng)溫度、接種量等條件有效提高了地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的能力，優(yōu)化后的菌株產(chǎn)酶酶活比之前提高了8.04倍。

本研究從共青地區(qū)的土壤中篩選分離得到產(chǎn)堿性蛋白酶活性較高的地衣芽孢桿菌，為后續(xù)在環(huán)境綠色友好型發(fā)展方面的相關(guān)研究及應(yīng)用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為后續(xù)對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行定向誘變，以滿(mǎn)足特殊工業(yè)化生產(chǎn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來(lái)源 2021年9月20日，采樣自江西省九江市共青城市的禽類(lèi)養(yǎng)殖地土壤，于實(shí)驗(yàn)室4℃保存，并進(jìn)行土壤處理及菌株篩選。具體詳情如表1所示。

表1 土樣采集信息

1.1.2 試劑 酪素/酪蛋白，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 及MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，均購(gòu)TAKARA公司；酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及福林酚試劑，均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 SW-CJ-1D型單人單面垂直凈化工作臺(tái)（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；RePure-A型基因擴(kuò)增儀（杭州柏恒科技有限公司）；DYY-8C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；WD-9413B 型凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠）；MDF-382E（N）型超低溫冰箱，（SANYO）；B203LEDR型生物光學(xué)顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）等。

1.1.4 培養(yǎng)基的配制 初篩培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖0.5、酪素10.0、NaCl 5.0、K2HPO40.5、K2HPO40.5、瓊脂20.0。pH值調(diào)至7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉 5.0、蛋白胨10.0、NaCl 15.0、瓊脂 15.0。pH 值調(diào)至7.3～7.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，斜面保藏培養(yǎng)基需另加入瓊脂15 g/L，擺成斜面?zhèn)溆谩?/p>

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨1.0、NaCl 5.0。pH值調(diào)至7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)基需另加入瓊脂15～20 g/L。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：（NH4）2HPO41.0、KCl 0.2、MgSO40.2、酵母膏0.2、糖類(lèi)（乳糖/麥芽糖/蔗糖/葡萄糖/阿拉伯糖/甘露醇）。使各成分溶解于水后，調(diào)整pH值為7.2～7.4，加入指示劑1.6%指示劑溴甲酚紫15 mL，定容后使滅菌后培養(yǎng)基pH值在25 ℃時(shí)為7.0±0.2，分裝試管，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

檸檬酸鹽培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 0.2、（NH4）H2PO41.0、K2HPO41.0、C6H5Na3O75.0、瓊脂15.0。使各成分溶解于水后，調(diào)整pH值為7.2～7.4，加入指示劑1%溴麝香草酚藍(lán)溶液10 mL，定容后使滅菌后培養(yǎng)基pH值在25 ℃時(shí)為7.0±0.2，分裝試管，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，擺成斜面?zhèn)溆谩?/p>

明膠培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、明膠120.0。調(diào)整pH值為7.0～7.2，定容后分裝于試管，121 ℃滅菌20 min。

丙酸鹽培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 0.2、（NH4）H2PO41.0、K2HPO41.0、CH3CH2COONa 2.0、瓊脂15.0。各成分溶解于水后，調(diào)整pH值為7.2～7.4，加入指示劑1%溴百里酚藍(lán)（溴麝香草酚藍(lán)）水溶液10 mL，定容使滅菌后培養(yǎng)基pH值在25℃時(shí)為7.0±0.2，分裝試管，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，擺成斜面?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基的配制均使用去離子水。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的分離篩選 菌株初篩。稱(chēng)取10 g土樣加入90 mL的無(wú)菌水（含20 mL玻璃珠）中，180 r/min振蕩混勻，90 ℃水浴1 h，放置室溫冷卻沉淀。取1 mL土壤上層懸液，加入裝有9 mL的無(wú)菌水的試管中混勻，并按10倍梯度稀釋至10-7。分別取10-5、10-6、10-73種濃度的菌液200 μL涂布于初篩培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。

菌株進(jìn)一步分離純化。挑取周?chē)兴馊Φ木溥M(jìn)行平板劃線，37 ℃培養(yǎng)后，挑取有水解圈的菌落繼續(xù)平板劃線，直至獲得單一菌株。

1.2.2 產(chǎn)堿性蛋白酶地衣芽孢桿菌的篩選與鑒定（1）形態(tài)學(xué)篩選鑒定。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［16］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［17］中地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)生中生孢子的形態(tài)學(xué)特征，將獲得的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和孔雀石綠芽孢染色進(jìn)一步篩選。

（2）生理生化篩選鑒定。根據(jù)《GB/T 26428—2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》［10］、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［16］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［17］，利用糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和阿拉伯糖，甘露醇）、明膠水解實(shí)驗(yàn)、7%氯化鈉生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、丙酸鹽實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、3%過(guò)氧化氫接觸酶實(shí)驗(yàn)等對(duì)菌株進(jìn)一步篩選。

（3）分子生物學(xué)篩選鑒定。使用TaKaRa公司的MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取目標(biāo)菌株的基因組DNA，經(jīng)20倍稀釋后作為模板，以27F和1541R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得菌株16S rDNA基因片段。16S rDNA序列擴(kuò)增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列［18］如下：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Tm=60 ℃；反向引物1541 R：5’-AAGGAGGTATCCACCC-3’，Tm=50 ℃。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，Taq（5 U/μL）0.2 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L/each）2.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 17.3 μL。

PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，50℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；72 ℃ 5 min ；95 ℃1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，15 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃恒溫。

將基因片段用TaKaRa公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒回收，并送上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST程序檢索比對(duì)并用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 堿性蛋白酶粗酶液的制備及酶活力測(cè)定 參考GB/T 23527—2009標(biāo)準(zhǔn)中的福林酚試劑測(cè)定法對(duì)堿性蛋白酶酶活的測(cè)定［19］。一個(gè)酶活單位的定義：在40 ℃，pH值為10.5的條件下1 mL酶液水解酪蛋白1 min產(chǎn)生1 pg酪氨酸所需要的酶量，酶活力單位為U/mL。

以酪蛋白作為底物，采用Folin-酚試劑法測(cè)定酶活。1 g酪蛋白溶于100 mL硼酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為10.5制備酪蛋白溶液（10 g/L）。發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min離心后取上清，1 mL上清液與1 mL酪蛋白溶液混勻40 ℃水浴保溫10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸混勻終止反應(yīng)，10000 r/min離心2 min，取濾液1.00 mL 加碳酸鈉溶液5.00 mL，加1∶1福林酚試劑1 mL，在40 ℃水浴保溫顯色20 min，于波長(zhǎng)680 nm下，置于10 mm比色皿測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得單一菌株的形態(tài)特征

通過(guò)對(duì)取得土樣制備孢子懸液，并進(jìn)行梯度稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基，將能夠產(chǎn)生水解圈的菌落進(jìn)一步通過(guò)平板劃線進(jìn)行菌落分離，最終獲得能夠分解利用初篩培養(yǎng)基中的酪蛋白的單一菌落。其中菌株2-1-1在初篩培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1所示，可觀察到菌落呈米白色，且菌落上有圓環(huán)狀突起，周?chē)猿拾胪该鳡睿砻婀饣?/p>

圖1 菌株2-1-1菌落圖

2.2 形態(tài)學(xué)觀察確定獲得地衣芽孢桿菌

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［16］和《伯菌鑒定手冊(cè)》［17］中可知地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，還可產(chǎn)生中生孢子。故將獲得的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和孔雀石綠芽孢染色進(jìn)一步篩選，結(jié)果如表1所示。

表1 形態(tài)學(xué)特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果

其中菌落2-1-1的革蘭氏染色圖結(jié)果如圖2A所示，可觀察到菌株革蘭氏染色為桿狀，且菌體呈紫色，說(shuō)明菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌；孔雀石綠染色結(jié)果如圖2B所示，可觀察到菌體染色為紫紅色，且菌體中間有綠色，說(shuō)明菌株可產(chǎn)生芽孢，且為中生芽孢。故該菌株符合地衣芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)特征。

圖2 菌株2-1-1的染色圖（×100）

2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)篩選確定獲得地衣芽孢桿菌

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［16］和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［17］中芽孢桿菌屬特性對(duì)獲得的4株菌株進(jìn)行鑒定，并以生化系實(shí)驗(yàn)室中的枯草芽孢桿菌作為對(duì)照組，其結(jié)果見(jiàn)表2。生理生化實(shí)驗(yàn)性狀為：接觸酶、7%氯化鈉生長(zhǎng)、明膠水解均呈陽(yáng)性；檸檬酸鹽及丙酸鹽利用實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性；可利用葡萄糖產(chǎn)氣及常見(jiàn)糖類(lèi)如L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖產(chǎn)酸。

表2 生理生化特征實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象

2.4 16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

從以上實(shí)驗(yàn)中符合預(yù)期的菌株進(jìn)行基因組抽提，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其基因組DNA大小，預(yù)期其大小約為23 kb。結(jié)果顯示4株菌基因組條帶大小均在9416～23130 bp之間（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 各菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

以稀釋20倍的各菌株基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得菌株16S rDNA，再通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其16S rDNA大小，預(yù)期其大小約為1.5 kb。結(jié)果顯示4株菌16S rDNA條帶大小均在1 kb和2 kb之間（圖4），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖4 各菌株16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖

將與預(yù)期結(jié)果相符的菌株16S rDNA擴(kuò)增片段用TaKaRa 公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行片段回收，并送上海生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的 BLAST程序進(jìn)行檢索比對(duì)，同時(shí)還利用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining模型構(gòu)建出4株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5-8。結(jié)果顯示：菌株2-1-1與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisWSR-KSU302親緣關(guān)系最近（97.24%），在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中自然類(lèi)聚（圖5）；菌株2-1-2與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisSUM-KSU304親緣關(guān)系最近（97.90%），在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中自然類(lèi)聚（圖6）；菌株2-1-3與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisWSR-KSU302親緣關(guān)系最近（97.37%），在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中自然類(lèi)聚（圖7）；菌株3-1-1與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisstrain SIITMB5親緣關(guān)系最近（97.23%），在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中自然類(lèi)聚（圖8）。說(shuō)明篩選獲得的4株菌均為地衣芽孢桿菌。

圖5 菌株2-1-1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖6 菌株2-1-2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖7 菌株2-1-3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖8 菌株2-1-1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.5 4株地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

如圖9是在OD680nm處測(cè)定吸光度，以光密度A作為y軸，酪氨酸含量（微克數(shù)）作為x軸，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=0.0115x-0.0087，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985，K值在吸光值為1時(shí)酪氨酸的濃度，經(jīng)計(jì)算可得K=87.713。

圖9 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

在100 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1%的菌液，37 ℃于220 r/min搖床培養(yǎng)，48 h過(guò)夜發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵液10000 r/min離心取上清，測(cè)定并計(jì)算其粗酶液堿性蛋白酶活力。同時(shí)，將4株地衣芽孢桿菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其水解圈直徑（H）和菌落直徑（C），并計(jì)算它們的H/C的比值。4株菌在酪蛋白培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的水解圈情況和搖瓶培養(yǎng)各菌株發(fā)酵液中堿性蛋白酶的酶活情況如表3所示。結(jié)果顯示4株菌中2-1-1菌株的直徑比最大為3.96；同時(shí)其酶活也最高達(dá)805.53 U/mL。

表3 菌株水解圈情況及對(duì)應(yīng)產(chǎn)堿性蛋白酶活情況

3 結(jié)果與討論

本文從江西九江共青城市兩處禽類(lèi)養(yǎng)殖地土壤中共篩選出4株產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌。通過(guò)酪蛋白培養(yǎng)基的初篩，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生化鑒定和分子學(xué)鑒定，確定4株細(xì)菌皆為地衣芽孢桿菌，并分別命名為菌株2-1-1、菌株2-1-2、菌株2-1-3和菌株3-1-1。利用Folin-酚試劑法測(cè)定4株菌株堿性蛋白酶的酶活，經(jīng)測(cè)定，菌株2-1-1的酶活力最高，可達(dá)805.53 U/mL，其他3株菌株的酶活依次為688.87 U/mL、593.91 U/mL和729.40 U/mL。

本文立足于共青地區(qū)羽絨加工制造的特色支柱產(chǎn)業(yè)，依托共青地區(qū)廣泛分布的禽類(lèi)養(yǎng)殖場(chǎng)所和大型羽絨服制造廠，為前期研究工作提供了豐富的土壤資源。后續(xù)工作可圍繞菌株誘變育種和完善培養(yǎng)條件來(lái)提高其產(chǎn)酶能力、堿性蛋白酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)等方面深入探索，為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，有助于開(kāi)發(fā)共青地區(qū)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的土壤生物資源。另外，本文利用堿性蛋白酶粗酶液測(cè)得堿性蛋白酶酶活，且酶活力較高，經(jīng)分析該粗酶液為混合酶液，由于實(shí)驗(yàn)室條件及經(jīng)費(fèi)的限制，我們目前無(wú)法得知所篩選獲得的地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的種類(lèi)組成，分析其酶類(lèi)組成，可能探索出目前尚未發(fā)現(xiàn)的新型高活力堿性蛋白酶并為后續(xù)探究該新型酶在實(shí)際應(yīng)用上的潛在功能奠定了基礎(chǔ)。