CDCA8通過調(diào)控增殖促進前列腺癌發(fā)生的作用機制研究

任智星，楊光華

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi)，PCa 發(fā)病率居男性所有惡性腫瘤的第2 位，僅次于肺癌［1］。在美國，PCa 的發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位，病死率居第2位［2］。我國是前列腺癌發(fā)病率和病死率相對較低的國家之一，但近年來隨著人均壽命的延長和疾病篩查手段的進步，PCa發(fā)病率呈持續(xù)快速增長趨勢［3］。傳統(tǒng)治療手段如手術(shù)、雄激素剝奪療法、放療和化療僅對早期PCa 有效，對進展期PCa 治療效果較差。為改善進展期PCa 治療效果，需不斷探索新的治療靶點。目前，采用免疫和靶向療法治療進展期腫瘤前景廣闊。細胞分裂周期相關(guān)蛋白8（CDCA8）在人體組織中廣泛表達，參與細胞分裂，為真核細胞內(nèi)紡錘體和微管穩(wěn)定所必需［4］。研究顯示，CDCA8 過度表達于乳腺癌、肺癌和肝癌等惡性腫瘤中，且與腫瘤的生長及預(yù)后密切相關(guān)［5-7］。然而，分析CDCA8在PCa中作用的相關(guān)研究較少。本研究對PCa 中CDCA8 的表達和作用機制進行初步探討，旨在為PCa 的治療提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2018年1月—2020年12月因PCa在山西白求恩醫(yī)院行根治性前列腺切除術(shù)的56 例患者的術(shù)后標本。納入標準：術(shù)前評估原發(fā)腫瘤臨床分期為T1～T3a，排除伴有骨轉(zhuǎn)移或其他臟器轉(zhuǎn)移。患者年齡55～76 歲，平均（66.66±2.38）歲。前列腺術(shù)后標本的使用均取得患者或直系親屬知情同意，獲得本院倫理委員會的批準。人PCa細胞株（PC3和DU145）購自美國ATCC 細胞庫。胎牛血清及RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，兔抗CDCA8抗體、Ki67抗體、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、蛋白激酶B（AKT）抗體、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抗體、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）抗體及鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自英國Abcam 公司，山羊抗兔或山羊抗鼠二抗購自武漢Proteintech 公司，lipofectamine 2000和TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司，F(xiàn)astStart SYBR?Green Master 購自德國羅氏公司，非蛋白變性細胞裂解液購自中國索萊寶公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）引物和小干擾RNA（siRNA）序列購自蘇州吉瑪公司。細胞培養(yǎng)箱購自美國THERMO公司，qPCR儀和Western blot設(shè)備購自美國Bio-Rad公司。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘 采用GEPIA 網(wǎng)站數(shù)據(jù)分析工具（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=CDCA8）比較癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中PCa組織和GTEx（Genotype-Tissue Expression）數(shù)據(jù)庫中正常前列腺組織中CDCA8 mRNA水平差異。將TCGA數(shù)據(jù)庫中PCa組織的CDCA8 mRNA 表達測序數(shù)據(jù)由小到大排列，前50%患者定義為CDCA8 mRNA低表達組（n=248），后50%患者定義為CDCA8 mRNA 高表達組（n=248），隨訪期間出現(xiàn)PCa 復(fù)發(fā)定義為事件發(fā)生，比較2組患者的無病生存期（DFS）。

1.3 免疫組化檢測CDCA8蛋白表達 將前列腺術(shù)后石蠟塊標本以4 μm厚度切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后由2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師再次予以明確PCa 組織和癌旁組織的病理學(xué)診斷。切片經(jīng)抗原修復(fù)后，用2%的BSA封閉30 min，隨后用兔抗CDCA8抗體（1∶400）孵育切片4 ℃過夜。室溫下羊抗兔二抗（1∶500）孵育2 h，最后在顯微鏡觀察下進行顯色反應(yīng)并適時終止，由2 名研究人員各自隨機讀取5 個高倍鏡視野進行觀察評分。細胞染色評分：0 分，＜5%細胞染色；1分，5%～24%細胞染色；2分，25%～49%細胞染色；3分，≥50%細胞染色。染色強度評分：0分（無或輕度染色）、1分（中度染色）和2 分（重度染色）。CDCA8 的表達水平用染色指數(shù)表示。染色指數(shù)=染色細胞評分×染色強度評分。根據(jù)每例患者PCa組織和癌旁組織的CDCA8染色指數(shù)分析CDCA8蛋白的表達差異。PCa組織染色指數(shù)為0～2的患者定義為CDCA8蛋白低表達組（25 例），PCa 組織染色指數(shù)為3、4 和6 的患者定義為CDCA8 蛋白高表達組（31 例），分析PCa 患者CDCA8表達水平與臨床特征的關(guān)系。

1.4 臨床資料收集 收集患者總前列腺特異性抗原（tPSA）、Gleason 評分、T 分期、術(shù)后組織切緣情況。根據(jù)前列腺癌預(yù)后風(fēng)險標準［8］，將tPSA 以10 μg/L 分界，＜10 μg/L 為低危，≥10 μg/L為中高危；Gleason評分以7分界，＜7分為低危，≥7分為中高危。

1.5 PCa 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將PC3 和DU145 細胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過Lipofectamine 2000將siRNA轉(zhuǎn)染到PC3和DU145細胞中用于沉默CDCA8基因，將細胞分為沉默組（Si-CDCA8組）和對照組（Si-NC 組）。siRNA 目標序列：5′-GGUUUGACUCAAGGGUCUUTTAAGACCCUUGAGUCAAACCTT-3′。

1.6 qPCR檢測CDCA8 mRNA表達水平 使用TRIzol試劑提取Si-CDCA8組及Si-NC組PCa細胞中總mRNA。通過UEIrisⅡRT-PCR系統(tǒng)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后進行qPCR反應(yīng)，GAPDH 為內(nèi)參。CDCA8 引物：上游5′-GAAGGGCAGTAGTCGGGTG-3′；下游5′-TCACGGTCGAAGTCTTTCAGA-3′。GAPDH引物：上游5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3′；下游5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3′。反應(yīng)體系10 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 2 μL，F(xiàn)astStart SYBR?Green Master 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，45 個循環(huán)。實驗重復(fù)3次。mRNA數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.7 細胞克隆形成實驗檢測PCa細胞增殖能力 6孔板中每孔大約接種1 000個PCa細胞，置于37 ℃5%CO2恒溫箱中孵育。其中3孔接種Si-CDCA8組細胞，另3孔接種Si-NC組細胞。培養(yǎng)2周后，4%多聚甲醛固定細胞，0.2%的結(jié)晶紫溶液染色2 min。去離子水多次洗滌后晾干，使用Image J 軟件計算2組細胞集落數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.8 Western blot 檢測PCa 細胞中CDCA8、PCNA、Ki67、p-PI3K、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平 使用非蛋白變性細胞裂解液裂解PCa細胞，提取并測定總蛋白濃度。每泳道加入40 μg蛋白樣品行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后將已分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚乙烯氟化物（PVDF）膜上。用脫脂牛奶封閉PVDF 膜2 h，目標蛋白CDCA8（1∶800）、PCNA（1∶1 000）、Ki67（1∶1 000）、p-PI3K（1∶3 000）、PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶2 000）、p-AKT（1∶5 000）一抗孵育PVDF 膜并在4 ℃冰箱中過夜，GAPDH（1∶5 000）作為內(nèi)參。室溫下用山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶3 000）孵育PVDF膜1 h。隨后用ECL顯影試劑曝光蛋白條帶。Image J 軟件用于定量分析蛋白相對表達量。蛋白相對表達量=目標蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，癌旁組織和癌組織組間比較采用配對樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson法。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較使用Wilcoxon 秩和檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用Pearsonχ2檢驗或連續(xù)校正χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman法。生存期比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa 組織和正常前列腺組織中CDCA8 mRNA水平比較 TCGA數(shù)據(jù)庫中PCa組織（n=496）CDCA8 mRNA 水平較GTEx 數(shù)據(jù)庫中正常前列腺組織（n=152）升高［1.446（1.124，1.841）vs.0.791（0.621，1.030），Z=13.330，P＜0.01］。

2.2 PCa 患者CDCA8 mRNA 低表達組與高表達組DFS 比較 CDCA8 mRNA 高表達組患者預(yù)后更差，中位DFS為82.4個月，2組患者DFS差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=16.830，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Comparison of DFS between the CDCA8 mRNA high expression group and the CDCA8 mRNA low expression group圖1 CDCA8 mRNA高表達組和低表達組DFS比較

2.3 PCa組織和癌旁組織CDCA8表達水平比較 前列腺組織切片中，PCa 組織CDCA8 的蛋白表達水平明顯高于癌旁組織［2.79±0.89vs.1.68±0.83，t=13.296，P＜0.01］，見圖2、3。

Fig.2 The expression of CDCA8 in PCa tissues(immunohistochemical staining,left×100,right×200)圖2 PCa組織中CDCA8的表達（免疫組化，左×100，右×200）

Fig.3 The expression of CDCA8 in paracancerous tissues(immunohistochemical staining,left×100,right×200)圖3 前列腺癌旁組織中CDCA8的表達（免疫組化，左×100，右×200）

2.4 PCa 患者臨床特征與CDCA8 蛋白表達相關(guān)性分析 患者tPSA、Gleason 評分、T 分期和術(shù)后切緣情況與CDCA8 蛋白表達呈正相關(guān)（r分別為0.481、0.627、0.281和0.467，P＜0.01）。CDCA8蛋白高表達組tPSA≥10 μg/L、T3期、術(shù)后切緣陽性患者比例高于CDCA8蛋白低表達組（P＜0.05）。見表1。

2.5 Si-CDCA8組和Si-NC組CDCA8 mRNA及蛋白比 較 qPCR 和Western blot 顯 示Si-CDCA8 組CDCA8 mRNA 和蛋白水平均明顯低于Si-NC 組（P＜0.01），見表2，圖4。

2.6 Si-CDCA8 組和Si-NC 組細胞增殖能力比較 Si-CDCA8 組細胞集落數(shù)減少，增殖能力減弱（P＜0.01），見表3，圖5。

Tab.1 Clinicopathological characteristics and CDCA8 expression of PCa patients between the two groups表1 2組前列腺癌患者的臨床特征和CDCA8組織表達情況比較

Tab.2 Comparison of CDCA8 mRNA and protein expression between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表2 Si-CDCA8組和Si-NC組CDCA8 mRNA及蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of CDCA8 mRNA and protein expression between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表2 Si-CDCA8組和Si-NC組CDCA8 mRNA及蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

Fig.4 Expression levels of CDCA8 proteins in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group圖4 Si-CDCA8組和Si-NC組CDCA8蛋白表達水平

Tab.3 Comparison of cell colony number between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表3 Si-CDCA8組和Si-NC組細胞集落數(shù)比較 （n=3，個/視野，±s）

Tab.3 Comparison of cell colony number between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表3 Si-CDCA8組和Si-NC組細胞集落數(shù)比較 （n=3，個/視野，±s）

＊＊P＜0.01。

2.7 Si-CDCA8 組和Si-NC 組Ki67 和PCNA 表達水平比較 Si-CDCA8 組Ki67 和PCNA 蛋白表達水平較Si-NC組明顯降低（P＜0.01），見表4，圖6。

Tab.4 Comparison of Ki67 and PCNA expression levels between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表4 Si-CDCA8組和Si-NC組Ki67和PCNA表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of Ki67 and PCNA expression levels between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表4 Si-CDCA8組和Si-NC組Ki67和PCNA表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

Fig.5 The number of cell colonies in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group圖5 Si-CDCA8組和Si-NC組細胞集落數(shù)

Fig.6 Expression levels of Ki67 and PCNA in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group圖6 Si-CDCA8組和Si-NC組Ki67和PCNA表達水平

2.8 Si-CDCA8組和Si-NC組PI3K/AKT通路蛋白表達水平比較 Si-CDCA8組PI3K、p-PI3K、p-AKT 表達水平較Si-NC組降低（P＜0.01），見表5，圖7。

3 討論

CDCA8蛋白是染色體乘客復(fù)合物（CPC）成分之一，CPC 包含4 個成員：Aurora B、著絲粒中心蛋白、Survivin及CDCA8［9］。在胞質(zhì)分裂過程中，CPC可以促進和調(diào)節(jié)中央紡錘體的形成，并決定細胞卵裂溝的位置［10］，在腫瘤細胞過度增殖中起重要作用。而CPC 與核小體的結(jié)合主要涉及CDCA8 介導(dǎo)的復(fù)雜機制［11］，因此CDCA8可能影響腫瘤發(fā)生。

Tab.5 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表5 Si-CDCA8組和Si-NC組PI3K/AKT通路蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of PI3K/Akt pathway protein expression between the Si-CDCA8 group and the Si-NC group表5 Si-CDCA8組和Si-NC組PI3K/AKT通路蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

Fig.7 Expression levels of PI3K/AKT pathway protein in the Si-CDCA8 group and the Si-NC group圖7 Si-CDCA8組和Si-NC組PI3K/AKT通路蛋白表達水平

本研究通過對56 例患者PCa 術(shù)后組織進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，CDCA8 在PCa 組織中的表達水平較癌旁組織升高，且CDCA8 蛋白表達水平與tPSA、Gleason評分、T分期和術(shù)后切緣情況呈正相關(guān)，高表達CDCA8的PCa患者具有較高的tPSA、Gleason評分和臨床分期，術(shù)后更有可能出現(xiàn)手術(shù)切緣陽性，預(yù)后較差。另外，TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫中的測序數(shù)據(jù)也表明CDCA8 mRNA 水平在PCa 組織中較正常前列腺組織中更高，進一步證實CDCA8在PCa 發(fā)生及進展中的促癌作用。鑒于CDCA8 蛋白主要參與真核細胞有絲分裂，筆者推測CDCA8可能是PCa 發(fā)生的一個觸發(fā)因素，并作為癌基因參與多種惡性腫瘤的進展。研究顯示，CDCA8的過度表達與肝細胞癌患者的低生存率顯著相關(guān)；在肝癌細胞中，沉默CDCA8 可抑制細胞周期蛋白B1 和磷酸化的細胞分裂周期蛋白2 的表達，并誘導(dǎo)G2/M 期細胞阻滯［5］。CDCA8是影響乳腺癌細胞增殖的關(guān)鍵因素［6］。另有研究表明，CDCA8的過度表達可促進黑色素瘤的進展，且與其不良預(yù)后相關(guān)［12］。與相對應(yīng)的癌旁正常組織相比，CDCA8在肺癌組織中表達上調(diào)［7］。CDCA8顯著促進骨肉瘤細胞的增殖［13］，其在癌癥組織中表達上調(diào)，而在正常組織中低表達［14-15］。因此，CDCA8基因在調(diào)節(jié)細胞生長、分化和凋亡等過程中起重要作用［9，16］。本研究結(jié)果顯示CDCA8在前列腺癌細胞過度增殖中起促進作用，與上述各項研究基本一致。

PCNA蛋白主要定位于細胞核，在細胞周期S期大量表達，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其表達水平與細胞增殖水平一致，可用于評估細胞增殖和侵襲能力［17］。Ki67是一種細胞增殖核抗原，用來標記處于增殖周期中的細胞，常作為腫瘤細胞增殖活性的標記［18］。本研究中，沉默CDCA8 基因后，PCa細胞的增殖能力受到限制，且細胞內(nèi)Ki67 和PCNA蛋白含量也隨之下降，表明CDCA8 基因可以調(diào)控PCa 細胞增殖。周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1（P21/CDKN1A）是細胞增殖的抑制因子，它可與PCNA 競爭結(jié)合抑制DNA 的合成，從而影響細胞增殖和分化；沉默CDCA8 后P21/CDKN1A 蛋白表達上調(diào)，PCNA 蛋白表達下調(diào)，細胞周期停滯于G2/M期［19］。P21主要受P53調(diào)控，參與DNA損傷修復(fù)、細胞增殖、凋亡和細胞周期等生物學(xué)過程，與PI3K/AKT 信號通路關(guān)系密切。PI3K/AKT 信號通路參與真核細胞多種生物學(xué)過程，如細胞增殖、分化、凋亡、周期、耐藥等，是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條重要通路［20］。本研究中，沉默CDCA8 基因后，PCa 細胞內(nèi)p-PI3K、p-AKT 表達水平下調(diào)，表明CDCA8 基因可上調(diào)PI3K 和AKT 的磷酸化水平，激活PI3K/AKT 信號通路。E2F 轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）是細胞核內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，以細胞周期依賴的方式調(diào)節(jié)細胞增殖。Cui 等［21］研究發(fā)現(xiàn)沉默肝癌細胞CDCA8 基因后，PCNA 和E2F1 表達降低，肝癌細胞增殖力減弱。故推測CDCA8 可能通過調(diào)節(jié)細胞增殖而參與PCa的發(fā)生，但具體分子機制仍需進一步深入研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)CDCA8 在人PCa 組織中表達上調(diào)，且CDCA8蛋白表達水平越高，PCa患者腫瘤分期越高，預(yù)后越差。此外，CDCA8 高表達能夠促進PCa細胞增殖，CDCA8通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控細胞增殖，參與前列腺腫瘤的發(fā)生，是PCa治療的潛在靶基因。